基因工程-6章重组DNA导入受体细胞.pptVIP

基因工程常用的受体细胞有: 大肠杆菌 枯草杆菌 土壤农杆菌 酵母菌 植物细胞 动物细胞 技术的忧患 1.基因污染： 人工组合的基因，可能会通过转基因作物或家养动物扩展到其他栽培作物或自然界野生物种，并成为后者基因的一部分。这就是基因污染。 2.基因武器 运用遗传工程技术，按人们需要，在一些致病细菌或病毒中，接入能对抗普通疫苗或药物的基因，产生具有显著抗药性的致病菌；或者在一些本来不会致病的微生物体内接入致病基因，而制造出新的生物制剂。 发展前景 生物学的研究表明，在地球上有许多动物具有很多种优良的特性，是我们所不具备而又想具备的（猫头鹰可以在黑夜看清东西；壁虎有再生能力）。如果我们具备了地球上200种生物所有的优良特性，我们的威力将会多么的强大！生物工程的发展表明，这是完全有可能的。 磷酸钙-DNA共沉淀法 3、共转化（植物细胞） 共转化(cotransformation) 基因工程中将两个以上的基因同时导入感受态真核细胞的方法，又称共转染。 适用于对不带有可选择标记性状的目的基因进行研究。 * * 将目的基因表达载体DNA和标记基因表达载体DNA混合后共同转移到靶细胞中，分别使用标记基因与目的基因对应的选择剂进行两次筛选，最后可得到复合转导的转化子。 共转化常用的报告基因:胸苷激酶基因(tk基因)、抗新霉素基因(neor)、鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因(XGPRT)等。 * * 4、电转化 电转化又称电穿孔法(electroporation): 是指在细胞上施加短暂、高压的电流脉冲，在质膜上形成纳米大小的微孔，DNA直接通过这些微孔或者作为微孔闭合时所伴随发生的膜组分重新分布通过质膜进入细胞质中，这种方法称为电穿孔法。 最早用于将DNA导入真核细胞,1988年,Dower等人成功应用于大肠杆菌的转化。基本原理是利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔，形成可逆的瞬间通道,从而促进外源DNA的有效吸收。 * * 电穿孔转化法的效率受电场强度、电脉冲时间和外源DNA浓度等参数的影响，通过优化这些参数，每μg DNA可以得到109～1010转化子。 电压增高或电脉冲时间延长时，转化效率将会有所提高，但同时导致受体细胞存活率的降低，转化效率的提高也因此被抵消。 * * * * 电穿孔法 * * 5、基因枪法 基因枪法(又称粒子轰击法) 用高压气体加速把粘有DNA的细微金粉(或钨粉颗粒)打向细胞，穿过细胞壁、细胞膜、细胞质等层层构造到达细胞核，完成基因转移的方法。 基因枪法适用于动植物组织或细胞、胚胎、细菌及小动物等。 基因枪法特点：快速、简便、安全、高效。 * * * * 6、微注射技术 微注射技术：一般是用微吸管吸取供体DNA溶液，在高倍倒置显微镜下准确地插入受体细胞核中，并将DNA注射进去。常用于转基因动物研究。 * * 7、脂质体导入法 脂质体也称人工细胞膜，是由脂质双分子层组成的，磷脂分子在水中可自动生成闭合的双层膜,从而形成一种囊状物被称为脂质体。 脂质体导入法:将DNA或RNA包囊于脂质体内，然后进行脂质体与细胞膜的融合，通过融合导入细胞,这种转染方法称为脂质体导入法。 * * 脂质体介导转染的机制 阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用将DNA分子包裹人内，形成DNA一脂复合体，也能被表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过膜的融合或细胞的内吞作用，偶尔也通过直接渗透作用,将DNA传递进入细胞，形成包涵体或进入溶酶体,其中一小部分DNA能从包涵体内释放,并进入细胞质中,再进一步进入核内转录、表达。 * * 本章重点掌握的内容 概念:受体细胞、电穿孔法、共转化、基因枪法、感受态细胞、转化、转染、磷酸钙-DNA共沉淀法、微注射技术。 选择受体细胞的基本原则 氯化钙转化法的基本原理 脂质体介导法及其转染的机制 常用的基因导入受体细胞的方法。 原核生物细胞作为受体细胞的优点与缺点。 酵母菌作为受体细胞的优点。 哺乳动物细胞作为受体细胞的优点与缺点。 * * * 0.05-0.09mp 350-680m\s2-4cell 14-18kv * * 载体与目的基因连接后，体系中可能存在下列分子：　　a. 未连接的载体分子　　b. 未连接的DNA片段　　c. 载体的自连　　d. 含有错误插入片段的重组DNA分子　　e. 重组DNA分子 转化过程中，这些分子同时被转移到宿主细胞内。 未连接的分子即使被细菌摄取，寄主的酶可降解这些DNA片段。 自连的载体和错误插入的重组质粒可以进入宿主细胞进行正常的复制 重组DNA技术操作过程可形象归纳为 分 分离目的基因 切 限制酶切目的基因与载体 接 拼接重组体 转 转入受体菌 筛 筛选重组体 第六章 重组DNA导入