大肠杆菌感受态细胞的制备和转__[1].pptVIP

大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 实验原理 实验仪器 实验试剂 实验步骤 注意事项 实验原理 进行基因克隆时，体外连接的重组DNA分子导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、增殖和表达。 感受态细胞(Competent cells):受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞。 转化（transformation）：将外源DNA分子导入细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。 进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。 转化的方法： 化学的方法(热激法)：使用化学试剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA分子导入受体细胞。电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。 CaCl2法是目前实验室常用的制备感受态细胞的方法，其原理是使细菌处于0℃、 CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性发生改变，外源DNA附着于细胞膜表面，经42 ℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物。宿主细胞一般是限制性内切酶修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，而质粒载体携带有某一抗生素抗性基因，如抗氨苄青霉素的基因（Amp＋）。若将转化的细胞涂布与于含氨苄青霉素的平板上，则只有那些含有被转化质粒的细胞才能生存并生长增殖，从而可以筛选出哪个克隆含有质粒。 热激法转化效率为106 ～107转化子/μg DNA。 电转化法是利用瞬间高压（10万伏/10ms）在细胞上打孔，因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。转化效率为109～1010 转化子/μg DNA。 克隆的筛选： 主要用不同抗生素基因筛选。常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等； 将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，才能较容易地筛选出转化体，即带有异源DNA分子的受体细胞。否则，如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素的培养基平板上，会出现成千上万的细菌菌落，将难以确认哪一个克隆含有转化的质粒。虽然只有那些含有被转化质粒的细菌才能在含有抗生素的平板上生长和繁殖，但对于连接混合物而言，此时并不能确定哪个克隆含有插入片段。 重组质粒克隆的鉴定 鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有?α-互补、小规模制备质粒DNA进行酶切分析、插入失活、PCR以及杂交筛选的方法。 最常用的方法是小规模制备质粒DNA进行酶切分析，对于带有LacZ基因的载体还可以结合α -互补现象来筛选。 α-互补现象： 因为许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和N端146个氨基酸的编码信息，编码 α-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型β -半乳糖苷酶实现基因内互补（α-互补）。当这种载体转入可编码β －半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所以称这种现象为α -互补现象。 由互补产生的β－半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNA片段时，会造成LacZ(β－半乳糖苷酶)基因的失活，破坏α-互补作用，就不能产生具有活性的酶。所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。 实验仪器 1 ．超净工作台 2 ．低温离心机 3 ．恒温摇床 4 ．恒温培养箱 5 ．-80 ℃ 冰箱 6 ．制冰机 7 ．移液器 50ul 、200ul 、1000ul 实验试剂 １．氨苄（母液50mg/ml，终浓度为50ug/ml）： 2ml母液需氨苄100mg ２．CaCl2(终浓度20mM)：需贮液1M 、20ml，需 CaCl2固体4g ３．MgCl2(终浓度80mM)：需贮液1M 40ml，需 MgCl2固体4g ４．甘油：500ml 实验步骤 CaCl2感受态细胞的制备实验步骤 电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤