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1 .什么叫基因工程（Gene Engineering），试从理论和技术两个方面谈谈Gene Engineering诞生的基础？ 基因工程：在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之参入到原来没有这类分子的宿主细胞内，而能持续稳定地繁殖。 理论基础：① 1944年，美国生物学家Avery等通过细菌转化研究，证明DNA是基因载体，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，从而明确了遗传的物质基础问题； ②1953年Watson和Crick建立了DNA分子的双螺旋结构模型， 1958年至1972年揭示了先后确立了中心法则，破译了64种密码子 技术基础：①20世纪60年代末70年代初，限制性核酸内切酶和DNA连接酶的发现使DNA分子进行体外的切割和连接成为可能； ②1972年首次构建了一个重组DNA分子，提出了体外重组的DNA分子如何进入宿主细胞，并在其中进行复制和有效表达等问题。经研究发现，质粒分子是承载外源DNA片段的理想载体，病毒，噬菌体的DNA(或RNA)也可改造成载体 ③1973年大肠杆菌转化体系的建立，这实验结果说明基因工程问世，不仅宣告质粒分子可作为基因克隆载体，能携带外源DNA导入宿主细胞，并且证实真核生物基因可转移到原核生物细胞中，并在其中实现功能的表达（基因工程诞生的元年） 克隆：作为名词使用时，是指某一个体（或细胞、分子等）通过无性繁殖的方式产生的具有相同遗传背景的后代（或子细胞、分子等）组成的集体（或群体）；作为动词使用时，指产生上述集体或群体的过程。 质粒小量提取中,溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ作用是什么? 溶液Ⅰ是使细胞完全分散 溶液Ⅱ是使细胞壁破裂，DNA变性 溶液Ⅲ是使质粒选择性复性，而染色体DNA随同SDS和蛋白质一起沉淀下来 限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease）：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4—8bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)限制片段长度多态性：指用某一种限制性内切酶来切割来自不同个体的基因组DNA或某一个基因，会得到不同长度的DNA片段。可用于基因组图谱构建、致病基因检测、基因定位、生物进化和分类的研究等 ?限制性图谱（restriction map):是指一系列限制酶的特异识别序列在DNA链上的出现频率和它们之间的相对位置。又称物理图谱（physical map) 核酸限制性内切酶的类型及主要特性 特性 I类内切酶 II类内切酶 III类内切酶 限制和修饰活性 单一多功能的酶 内切酶和甲基化酶分开 共同亚基的双功能酶 内切酶的蛋白结构 3种不同的亚基 单一成分 2种不同的亚基 限制作用所需要的辅助因子 ATP、Mg2+和SAM Mg2+ ATP、 Mg2+和SAM 寄主特异性位点识别序列 EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC 回文序列 （IIs型除外） EcoP1: AGACC EcoP15: CAGCAG 切割位点 在距离识别位点至少1000 bp处随机切开一条单链。 位于寄主特异性位点或其附近 距寄主特异性位点3‘端24—26bp处 酶催转换 不能 能 能 DNA易位作用 能 不能 不能 甲基化作用的位点 寄主特异性位点 寄主特异性位点 寄主特异性位点 识别未甲基化的序列进行切割 能 能 能 序列特异的切割 不是 是 是 基因工程中的用途 无用 十分有用 ? 常用的DNA聚合酶的特点 共同特点 ：把dNTPs连续地加到引物的3’—OH端。 主要区别：持续合成能力和外切酶活性不同。2 T7 DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。 3. 常用DNA聚合酶的特性比较 DNA聚合酶 3’?5 5’?3 聚合速率 持续能力 大肠杆菌DNA聚合酶 低 有 中 低 Klenow fragment 低 无 中 低 T4DNA聚合酶 高 无 中 低 T7DNA聚合酶 高 无 快 高 化学修饰T7DNA聚合酶 低 无 快 高 遗传修饰T7DNA聚合酶 无 无 快 高 逆转录酶 无 无 低 中 Taq DNA聚合酶 无 有 快 高 Taq聚合酶： TaqDN聚合酶的最大特点是热稳定性，耐高温，非常适合PCR过程的反复高温变性要求。最适温度高 75-80 oC 功能缺点，具有5’?3’聚合酶活性和5’?3’外切酶活性，但没有3‘?5’外切酶活性。 因此不能修复错误的碱基配对！Taq DNA聚合酶的激活剂 金属离子敏感（尤其是Mg2+ 末端脱氧核苷酸转移酶（terminal tra