玉米叶片原生质体拟制备转化操作流程(1).docVIP

玉米叶片原生质体拟制备转化操作流程 一、生长条件 用0.2%的次氯酸钠对玉米种子消毒10min，再用蒸馏水冲洗3~5次，浸种8 h，将种子均匀铺在潮湿滤纸上催芽（28℃黑暗），待幼芽长到1cm左右时选取萌发一致的幼芽种在Hoagland营养液，然后将幼芽置于光照培养箱中培养。培养条件为黑暗条件下，28/22℃（昼/夜），400 μ mol· m-2·s-1，相对湿度为75%±5 %，营养液每天更换一次。至幼苗第二片叶子完全展开。 注：也可以使用正常环境下生长的玉米幼苗（二叶期之前，否则叶片太老不易分离原生质体），在提取原生质体前，提前进行黑暗处理1~2天。 二、原生质体分离与纯化 (1) 切取第二片叶的中部（6-8cm）。将几个片叶叠在一起，轻压，用双面刀片无伤害地切成0.5mm的细条。好的操作每克鲜重叶片能产生大约107个原生质体。 (2) 用枪头将切好的细条均匀分散在酶解液中，0.1 MPa压力，抽真空1 h，避光。 1g叶片对应10ml酶解液。 (3) 消化，室温，40 r/min，轻摇2~3 h，避光。这根据实验目的和反应情况来确定。这个步骤需依据自己的分析，经验性地测试。 (4) 室温，80 r/min，轻摇5 min，避光。(使原生质体大量释放) (5) 将消化好的原生质体用300目滤网（图1）过滤到50ml离心管中，弃沉淀，在滤液中加入适量W5，混匀，25℃ 50g(约700rmp) 离心5min。 (6) 取沉淀。再次向滤液中加入W5，离心取沉淀，至滤液为无色。将所得沉淀合成一管。 (7) 向沉淀中加入适量MMG重悬液(约1~2ml)，然后血球计数板计数，使原生质体数目为5~8×105个/mL。 (8) 在显微镜下观察原生质体的完整度。 三、40% PEG4000介导转化 (1) 取质粒10μl（质粒浓度约1μg/μl）放入新的2mlEP管中，加入MMG重悬液中的原生质体100ml，再加入等体积(110ml)的40% PEG4000，混匀。（需剪枪头） (2) 室温静置13-15分min。（避光） (3) 缓慢加入4倍体积的W5，混匀，静置5min。（避光） (4) 25℃ 50g(约700rmp) 离心5min，弃上清。重复2次，以去除PEG。 (5) 加1ml培养液，混匀，20~25℃避光培养12~18 h（根据实验目的和反应情况来确定）。处理完后镜检，或弃上清后放置-80℃备用。 图1 300目细胞过滤筛 母液： 1M KCl 称取0.745g溶于10ml去离子水中,灭菌。 1M MES 称取2.132g溶于10ml去离子水中,用KOH调PH值为5.7，灭菌。溶液呈微黄色。 1M MgCl2 称取0.95g溶于10ml去离子水中。 1M CaCl2 称取11.099g溶于100ml去离子水中。 0.8M 甘露醇 称取1.457g溶于10ml去离子水中。 A. 酶解液(现用现配) ： 20ml 40ml 纤维素酶1% 0.2g 0.4g 离析酶0.2% 0.04g 0.08g 甘露醇0.5M 1.367g 3.644g 1M kcl母液 400μl 800μl 1M MES母液 400μl 800μl 以20ml为例：再加入适量个去离子水，53℃水浴加热10min(为了钝化蛋白酶和提高酶的可溶性)，冷却至室温，混合液变成棕色且是透明。再加入1M CaCl2 400μl，BSA(牛血清蛋白)0.02g，用灭菌去离子水定容至20ml。最后加入5μl β-巯基乙醇，用0.42μM的滤膜过滤后使用。 PS：cellulase R10、macerozyme R10(Yakult Honsha，Tokyo，Japan) B. MMg重悬液(PH=5.7，灭菌）： 100ml 1M MgCl2 (15mM) 1.5ml 1M MES （4mM) 400μl 甘露醇 (0.6M) 10.932g 去离子水定容至100ml，灭菌121℃、18min，4℃存放。 C. 培养液(PH=5.7，灭菌）： 100ml 1M KCl (4mM) 400μl 1M MES （4mM) 400μl 甘露醇 (0.6M) 10.932g 去离子水定容至100ml，灭菌，4℃存放。。 D. W5(PH=5.7，灭菌）： 100ml 500ml NaCl 154mM 0.9g 4.5g 葡萄糖 5mM 0.09g 0.45g CaCl2 125mM 1.4g 7g KCl 5mM 0.037g 0.185g MES 2mM 200μl 1ml 去离子水定容，灭菌，4℃存放。 E. 40% PEG