第三章细胞破碎.pptVIP

第三章细 胞 破 碎;生物分离过程的一般流程;常见的细胞壁结构;概述;概述;概 述;3.1 细胞壁结构对破碎的影响;细菌细胞壁结构;细菌细胞壁结构; 酵母细胞壁的结构示意图;真菌的细胞壁;红面包霉菌细胞壁具有同心圆层状结构主要存在三种聚合物 最外层(a)是α-和β-葡聚糖的混合物， 第2层(b)是糖蛋白的网状结构 第3层(c)主要是蛋白质， 最内层(d)主要是几丁质。;微生物;植物细胞壁的结构;植物次生细胞壁;研 磨;机械破碎;一　机械法;采用高压匀浆器（由高压泵和匀浆阀组成）。;;高压匀浆器的种类;高压匀浆法使用时注意事项;高压匀浆法适用的范围;升高压力有利于破碎， 减少细胞的循环次数，甚至一次通过匀浆阀就可达到几乎完全的破碎，这样就可避免细胞碎片不至过小。 在工业生产中，通常采用的压力为55－70Mpa。 破碎性能还随菌体种类和生长环境的不同而不同 大肠杆菌的细胞比酵母细胞容易破碎， 生长在简单的合成培养基上的大肠杆菌比生长在复杂培养基上容易破碎。;高压匀浆法-X-挤压器;2）珠磨法 bead mill;高速珠磨机工作原理;Netzsch LM-20型珠磨机;3）超声波破碎;超声波破碎的机理;超声波破碎的适用范围;技术;非机械破碎方法;二 非机械法; 1 酶解（酶溶法 Enymatic lysis);外加酶法;外加酶法;酶解法的特点 ;酶解-自溶作用 ;某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。;;细胞破碎常用的表面活性剂： 十二烷基硫酸钠（SDS，阴离子型）；。 非离子型如Triton X-100和吐温（Tween）等 对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。;能分解细胞壁中的磷脂，使细胞结构破坏，胞内物质被释放出来。 有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等 ;通用性差； 时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%； 有些化学试剂有毒。 化学试剂的加入常会给随后产物的纯化带来困难， 并影响最终产物纯度;3 物理法;1）渗透压冲击法 ; 2）冻结-融化法;使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用??酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。 气流干燥主要适用于酵母菌，一般在25-30℃的气流中吹干； 真空干燥多用于细菌。 冷冻干燥适用于不稳定的生化物质;;选择破碎方法的依据：;选择性释放目标产物的一般原则;破碎技术的研究方向;破碎技术的研究方向-与上游过程相结合;（ inclusion bodies IBs);外源蛋白在大肠杆菌中的积累;包涵体：一种蛋白质不溶性聚集体，包括目标蛋白、菌体蛋白等。目标蛋白一级结构是正确的，但立体结构是错误的，所以没有生物活性。 包涵体的形成：大肠杆菌中目标产物的表达水平过高，超过正常代谢水平，过多表达产物聚集在细胞内，形成不溶性的包涵体。 高表达产生的积聚物在细胞内部形成不溶物原因？ 蛋白过量积聚，超过溶解度，导致沉淀； ②蛋白生成太快，分子间疏水基团相互作用而聚集沉淀； ③蛋白生成太快，分子内部二硫键的错误连接导致沉淀； ④表达蛋白过多，与其结合/诱导组分不足，不能形成溶解状态 ⑤蛋白质自身不稳定。;基因工程包涵体的纯化方法;包涵体获得几种常见的工艺路线(一);特点:是利用了包涵体与细胞碎片的密度差，用离心法将包涵体与细胞碎片和可溶性蛋白质分开，获得了干净的包涵体，再对包涵体溶解复性。 优点：摆脱了大量的杂蛋白、核酸、热原、内毒素等杂质，使后面的分离纯化简单了。从这个角度上讲，包涵体的形成对分离纯化亦有好处。 缺点:要经过几次离心才能除去大部分的细胞碎片，加工时间较长。;包涵体获得几种常见的工艺路线（二）; 路线（二）应用了膜分离技术，用微孔膜除去可溶性蛋白质。 优点是封闭式操作，不污染环境也不受环境污染，能量消耗也比离心法少。 缺点：细胞碎片和包涵体一起被膜挡住，难以分开；而且膜的堵塞和浓差极化常常导致可溶性蛋白质的滞留。;包涵体获得几种常见的工艺路线（三）;用化学法破碎，所采用的试剂既可以破碎又可以溶解包涵体，将两道工序和为一道，节省了设备和时间，比前两者更适合于实验室操作。 缺点是所有的可溶性杂质都没有除去，混杂在产物中间，给后续分离带来困难。;1）包涵体的洗涤 细胞破碎后，包涵体呈颗粒状，致密。 洗涤的重要性：收集的沉淀中，除包涵体外，还包括许多杂质，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，复性时会与目标蛋白一起复性形成杂交分子而聚集，给后步纯化带来困难。 洗涤剂：温和的表面活性剂、蔗糖、低浓度的弱变性剂（如尿素）或脱氧胆酸等。能溶解除去部分膜蛋白和脂质类杂质。 洗涤剂浓度以