Bcl2基因修饰的骨髓尽间充质干细胞对神经细胞缺血性损伤的保护作用.docxVIP

优秀毕业论文 精品参考文献资料 中国医科大学 博士学位论文 Bcl--2基因修饰的骨髓间充质干细胞对神经细胞缺血性损伤的 保护作用 姓名：何凡 申请学位级别：博士 专业：神经病学 指导教师：何志义 201004 ·中文论著摘要 ·中文论著摘要· Bcl．2基因修饰的骨髓间充质千细胞对神经细胞缺血性 损伤的保护作用 目 的 缺血性脑血管病是威胁人类健康的三大疾病之一，具有发病率、死亡率、致 残率及复发率高的特点，给家庭和社会带来沉重的精神和经济负担。超早期溶栓 治疗虽然证实有效，却受到治疗时间窗(3．6小时)和易诱发脑出血等副作用的限制， 目前急需寻找新的治疗途径。干细胞移植作为一种不同于传统治疗的全新方法可 以重塑受损的神经元通路和改善神经功能缺失，已成为缺血性脑血管病治疗方面 的研究热点。近年来，用于治疗缺血性脑血管病的干细胞包括神经干细胞(netural stem cell，NSC)和骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells， MSCs)。神经干细胞来源于人的脑组织或人胚胎干细胞，受到医学伦理限制，不 适合自体移植。骨髓间充质干细胞，是来源于骨萌的一种具有自我复制和多向分 化潜能的非造血干细胞，不仅可以分化为骨、软骨、脂肪等间质细胞，在适宜的 条件下，还能分化为神经细胞。与NSC相比，MSCs具有以下特点：(1)容易获 取，来源丰富，不存在伦理学争议；(2)可自体移植，避免了免疫排斥反应；(3) 体外容易扩增，能稳定、高效的表达外源基因。所以MSCs更适合用于缺血性脑 血管病的干细胞移植治疗。而MSCs移植入体内后的低成活率限制了其应用。Chen 等研究发现，MSCs的神经细胞转化率在体外可高达80％，而在体内仅约为3～ 10％，其原因虽然复杂，但主要是MSCs移植至体内后，其自身发生凋亡所致。 因此，如何减少其移植后凋亡的发生，提高MSCs在体内的存活率及向神经细胞 定向分化的能力是目前干细胞移植治疗脑缺血亟待解决的主要问题。Bcl．2基因(B cell lymphoma／leukemia gcne 2，Bcl一2 gene)是目前研究较为明确的抗凋亡基因。如 果将Bcl．2基因转染到MSCs，可能会减少移植后的MSCs的凋亡，提高MSCs的 存活率，从而解决这一难题。最近国外学者Li等将Bcl．2基因修饰的MSCs移植 入心肌梗死大鼠模型，发现Bcl 入心肌梗死大鼠模型，发现Bcl．2能够增加移植后的MSCs的存活率，并且不影 响MSCs的多向分化潜能，心肌梗死灶周围的毛细血管密度增加15％，心肌梗死 病灶缩小17％，心肌功能得到明显改善。目前国内外尚无移植Bcl．2基因修饰的 MSCs治疗脑缺血的相关报道，故本课题组拟将Bcl．2基因在体外转染至MSCs， 进一步拟研究Bcl．2基因转染的MSCs是否能够提高MSCS的抗凋亡能力，及在 体外是否具有向神经细胞分化的潜能。总之，为寻找简便、快捷、安全、有效的 治疗脑缺血的方法，本课题组拟采用慢病毒载体，在体外将抗凋亡基因Bcl．2转 染至MSCs，探索提高外源性MSCs移植到体内的存活率的新方法。从而为今后 临床应用MSCs治疗缺血性脑血管病打下坚实的理论和实验基础，为治疗该病开 辟一条新的有效途径。 方法 根据小鼠Bcl．2基因序列设计引物，在5’端分别加上attBl和attB2位点，以 小鼠cDNA为模板，上述设计引物进行PCR扩增。PCR产物通过电泳检测后进行 回收，纯化，BP结合反应．构建pDOWN．mBcl．2载体，pDOWN．mBcl．2载体的转 化和检测，LR结合反应．构建pLV／EXPN2．Puro．EFlA．mBcl．2表达载体，及其转 化和检测，慢病毒包装。测定Neomycin和Puromycin对F344大鼠MSCs的最适 筛选浓度，携带eGFP慢病毒转导F344大鼠MSCs，Neo筛选成功转导的MSCs， 携带mBe．12慢病毒转导MSCs．eGFP，puro筛选成功转导的MSCs，扩增转导后 的MSCs，RT-PCR法检测转染后Bcl．2的表达，采用血清剥夺和缺氧(SOD)处理 建立MSCs体外模拟缺血性损伤模型，通过流式细胞术评价转导Bcl．2基因的 MSCs(Bcl．2．MSCs)和未转染的MSCs的凋亡及存活情况。对Bcl．2．MSCs行神 经诱导及检测。大鼠新生鼠海马神经元细胞原代分离及培养，Bcl．2．MSCs与海马 神经元共培养，观察Bcl．2．MSCs对海马神经元缺氧的保护作用。 结 果 以小鼠Bcl．2基因cDNA为模板，经测序证实构建慢病毒载体成功，puro筛 选出成功转导Bcl．2基因的MSCs，Bcl．2．MSCs可稳定、高效的表达Bcl．2蛋白； 流式细胞术