PCR技术原理及实验操作2012年.pptVIP

用大量程的移液器移取小体积的液体 移液体积需保证在移液器所提供的量程范围之内才符合准确度和精确度数值的要求 吸取具有强挥发性的液体 如果一定要移取强挥发性的液体，应该在移液结束后立刻拆开移液器，让蒸汽挥发 移液速度和放液速度过快 慢吸慢放，不会产生气泡，移液准确 细节决定成败！ * 文字式缩写： ①P在碱基之左侧表示P在C5`上，反之，P在碱基之右侧，表示P与C3`相连。 ②有时多核苷酸中磷酸二酯键上的P也被省略，但一般左侧表示5`-磷酸端，而右侧表示3`-OH端。 * * * * * * * * * * PCR循环参数 94 ℃，3min；94 ℃，45s；58 ℃，1min； 循环30次72 ℃，1min；72 ℃，10min；16 ℃保温 （热力学参数） 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 DNA变性 形成2条单链 子链延伸 DNA加倍 94 ℃，3min；94 ℃，45s；58 ℃，1min； 循环30次72 ℃，1min；72 ℃，10min；16 ℃保温 94 ℃预变性，3min使DNA双链完全打开 退火： 58℃，1min 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合，降低温度可增加反应的灵敏性。 变性： 94 ℃变性，45s 使双链DNA解链为单链 延伸：72 ℃，1min 温度为Taq酶最适反应温度72 ℃ 时间由扩增片段的长度决定 1min扩增1KB 循环次数： 主要取决于模板DNA的浓度 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加 第二节 凝胶电泳(gel electrophoresis) 电泳概念 基本原理 Q μ＝ 6πrη μ: 迁移率 Q : 电荷量 r : 粒子半径（分子量） η: 介质粘度 电泳的用途 分离 鉴定纯度 测定分子量 凝胶电泳的种类 琼脂糖凝胶电泳(?) 聚丙烯酰胺凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳(agarose gel electrophoresis) 分离核酸原理 操作要点 应用范围 （一）分离核酸原理 电荷效应 分子筛效应 分子构象 1. 电荷效应 核酸是两性电解质 pH = 3.5 , 正电荷 pH = 8.0~8.3 , 负电荷，向正极移动 在电泳缓冲液中，DNA带负电荷，在电场作用下向正极移动 电泳不能使用蒸馏水，必须使用电泳缓冲液 2.分子筛效应 小分子移动快 ，大分子移动慢 3. 分子构象 闭环超螺旋线状DNA开环DNA + - （二）操作要点 支持物 凝胶浓度的选择 DNA分子量标准 电泳缓冲液 样品制备 电泳条件 DNA电泳染色 1. 支持物-琼脂糖 琼脂糖是由1，3连接的B-D-半乳呋喃糖和1，4连接的3，6脱水α-L-半乳呋喃糖相间联结而成。琼脂中除琼脂糖外，尚含有琼脂糖果胶(Agaropectin)和丙酮酸等带电荷基团分子，在琼脂糖制备过程中尽可能地去除掉这些带电荷分子，以便获得品质优良的电荷中性产品。 商品化的琼脂糖 西班牙琼脂糖agrose与 细菌培养用琼脂agar的区别 2. 凝胶浓度的选择 凝胶的制备 注意：使用电泳缓冲液进行配制；加热过程中要不时摇动，使附着于壁上的琼脂糖颗粒进入溶液溶解。 3. DNA marker 上样3μl，750bp条带为50ng，其它25ng 上样3μl，500bp条带为50ng，其它25ng DNA 长度标准曲线 4. 电泳缓冲液 Tris-乙酸(TAE)pH 8.0 Tris-硼酸(TBE) pH 8.0 Tris-磷酸(TPE) pH 8.0 凝胶制备时一定要使用电泳缓冲液 5. 样品制备 DNA 样品 每条带100ng 上样缓冲液 50%甘油/蔗糖 0.5%溴酚蓝/二甲苯青 作用：上色；沉降 点 样 6.电泳条件 恒压电泳 低压