猪瘟间接免疫的荧光实验.pptVIP

实验五 猪瘟的间接免疫荧光实验龙岩学院生命科学学院2015.5.25 一、实验目的： 了解和掌握猪瘟的临床诊断方法和实验室诊断方法（间接免疫荧光法）。 荧光免疫显微技术 直接法---荧光素标记Ab直接检测 间接法---荧光素标记二抗 补体结合法---荧光素标记抗补体Ab 双结合法---两种荧光素标记Ab 二、实验原理： 固定在载片上的待检病变组织与适当稀释的猪瘟阳性血清反应后，如果待检组织中有猪瘟病毒抗原就会与猪瘟阳性血清中的抗体特异性结合，加入FITC(异硫氰酸荧光素)标记的的兔抗猪IgG二抗又可与猪瘟阳性抗体特异性结合，在荧光显微镜下可见呈现绿色荧光。 荧光二抗 三、试剂与仪器： 1.猪瘟病料、抗原片、FITC荧光标记的兔抗猪二抗、PBS缓冲液、猪瘟标准阴、阳性血清、封片介质:磷酸盐缓冲甘油、盖玻片、滤纸 2.荧光显微镜、摇床、移液器、吸管等 荧光显微镜： 四、IIF操作步骤： １．准备：取病猪的扁桃体，淋巴结、脾或其他组织一小片，用滤纸吸去外面的液体。用笔编号、标记。 ２．触片：取干净载玻片一块，稍为烘热，将组织小片的切面触压玻片，略加转动，作成压印置室温内干燥。或用所采的病理组织，做成切片。 固定：滴加冷丙酮数滴，置–20℃固定15一20分。 清洗：用PBS（pH7.2）洗涤3次，每次5 min，阴干。 第一次温育：滴加25ul稀释后的血清覆盖触片样品，避免产生气泡。滴加完所有待测标本后才开始室温温育30分钟。 四、IIF操作步骤： 6．清洗：用磷PBS冲洗载片（注意水流不要太急，不要直接对着触片组织冲），然后立即将其浸入装有磷酸盐缓冲液的平皿中浸洗3次，每次5分钟。 7．第二次温育：滴上标记荧光抗体（30ul），置37℃饱和湿度箱内处理10—30分钟。 8．清洗：用pH7.2的PBS漂洗3次，每次5—10分钟。 9．封闭：干后，滴上甘油缓冲液数滴，加盖玻片封闭，用荧光显微镜检查。 10．结果判断：如细胞胞浆内有弥散性、絮状或点状的亮黄绿色荧光，为猪瘟，如仅见喑绿或灰蓝则不是猪瘟。对照试验用已知猪瘟病毒材料压印片先用抗猪瘟血清处理，然后用猪瘟荧光抗体处如上检查，应不出现猪瘟病毒感染的特异荧光。 五.注意事项: 1．触片要求均匀。 2．每次试验应该设阳性和阴性对照。 3 应注意荧光抗体的质量。 4. 标本应及时检测，并避光保存。 * 能够产生明显荧光并能作为染料使用的有机化合物称为荧光色素或荧光染料。用于标记抗体的荧光色素，必须具有化学上的活性基因，能与蛋白质稳定结合，且不影响标记抗体的生物活性及抗原抗体的特异性结合。 异硫氰酸荧光素(FITC) 发射波长（nm） 激发波长（nm） 发射的荧光色 荧光素 595 570 红 四乙基罗丹明 RB200 528 495 绿 异硫氰酸荧光素 （FITC） 荧光素及其激发波长和发射波长 生物薄片 生物薄片马赛克：将包被有不同基质的生物薄片固定在一个载片反应区中，可同时检测多种抗不同组织或病原体的抗体。 *