细胞破碎-王小建.pptVIP

前 言 细胞破碎是了解细胞组成和结构,获得细胞内含物的必要手段。 胞内的生物活性物质的稳定性差,条件不适极易失活。特别是微生物细胞十分微小,细胞壁结构比较紧密,一般方法不易将细胞打破,有些技术虽然可以,但条件严苛,胞内生物活性物质在此条件下很易失活,限制了一些技术应用。 在一定程度上细胞破碎仍是生物技术产业化关键技术。 2、细胞壁结构和组成 微生物细胞外膜使细胞具有刚性的外形,由胞质膜和细胞壁组成,其结构影响着细胞破碎。 胞质膜保持着细胞内外的物质浓度梯度,主要由蛋白质和脂类组成。没有细胞壁时,膜对渗透休克敏感,对其它破碎方法影响较小。 细胞壁是破碎的主要障碍,其组成和结构对细胞破碎有重要影响。细胞壁的组成和结构与遗传和环境因素有关,但在微生物的种属中也存在总结构上的相似性。 2、细胞壁结构和组成 1964年Salton首次利用机械破碎法破碎细菌细胞，对细菌细胞壁组成、结构和功能进行研究。尤其对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细胞壁结构有了较为全面认识。 除了菌质和一些L-型和嗜盐菌以外，几乎所有的细菌的壁的较坚硬部分都是由短肽交联的糖原链，即粘肽构成，围绕着细胞形成连续的网状结构，使细胞具有一定的形状和强度。 * 4. S-200凝胶层析 将包涵体溶液进行Sephacryl S-200柱层析（Φ10cm?120cm，粒径25-75μm）室温洗脱，检测器波长为280nm.洗脱液为50mmol/L PB-1％SDS（S-200凝胶层析洗脱液）室温下洗脱，收集最高色谱主峰。蛋白纯度可达90%以上。 5、复性 将S-200凝胶层析收集液过Sephadex G-25凝胶柱（Φ20cm?40cm, 粒径50-150μm），检测器波长为280nm ,洗脱液为50mmol/L PB-0.05％SDS(G-25凝胶层析洗脱液)，收集第1色谱峰。 用50mmol/L PB-0.05％SDS(G-25凝胶层析洗脱液)将G-25凝胶层析收集液进行稀释，室温搅拌20+2小时，恢复蛋白活性。 * 6. 复性后纯化 复性后蛋白 反相层析进行高度分离 洗脱液A相：0.1%三氟乙酸的注射用水溶液 洗脱液B相：0.1％三氟乙酸的乙腈溶液 以梯度程序洗脱样品， 纯度达96%以上（由SDS和RP-HPLC鉴定），蛋白收率大于35% * 白介素-2包涵体产物分离和蛋白提纯 * 小结 一、细胞壁结构和特点 二、细胞破碎的方法 三、细胞破碎率效果的检验 四、选择破碎方法的依据 五、破碎技术的发展方向 谢谢！ * 综合说明 由于细胞之间及目标产物之间性质差异很大，已有的破碎理论、破碎实验数据只能作为指导破碎操作的参考依据。 实际的破碎操作仍凭经验，即通过实验确定适宜的破碎器和破碎操作参数，获得最佳破碎效率。 提高破碎率意味着延长破碎操作时间或增加破碎操作次数，后者往往引起目标产物的变性或失活。 * 3.7细胞破碎技术未来研究发展方向 过度的破碎释放大量的胞内产物，给下游的分离纯化操作增加难度。 破碎操作应与整个下游加工过程相联系，在保证目标产物有效高收率的前体下，使下游加工过程的成本最低。 * 3.7细胞破碎技术未来研究发展方向 每种细胞破碎技术都有不足和应用的局限性。即使工业上应用的破碎技术，如球磨破碎、冷压释放破碎和高压释放破碎等，虽然有破碎效率高、成本低、简便等优点，但也有其不足,如因细胞破碎度高，胞内含物全部释放，大量的杂蛋白和核酸的释放使破碎物粘度很高，给后序的固-液分离带来困难，给产物分离纯化增加了负担；机械破碎的剪切力高，或因产生大量热量，易造成敏感的生物活性物质的失活。化学法虽然目前主要在实验室内小规模应用，大规模工业应用还存在许多问题，但也有许多独特的优点。因此，细胞破碎技术本身还远未达到完善的地步，还有大量的工作可做。 近几年有关文献仍然不少，特别是从上游和下游以及细胞破碎技术之间的相互融合和联系出发，发展了一些新方法。 * 多种破碎方法结合 与上游过程结合 1、培养过程控制 2、寄主细胞选择 3、克隆噬菌体溶解基因 4、耐高温产品的基因表达 与下游结合 从后分离过程考察细胞破碎技术 3.7细胞破碎技术未来研究发展方向 * 1）多种破碎方法相结合 原理：化学方法－－细胞壁的化学组成，机械法－－细胞结构的机械强度。细胞壁的组成影响细胞的机械强度－－采用二种方法相结合可利于细胞破碎。 如用蜗牛酶预处理面包酵母菌细胞，然后高速匀浆。在95MPa压力下匀浆4次，破碎率接近100％，而单独高压匀浆，同样条件下破碎率为32％。 机械破碎前预先用硫醇培养酵母细胞，可以大大提高胞内蛋白的收率。（糖苷酶被