融合蛋白的纯化.pptVIP

融合蛋白的纯化 一、蛋白质分离纯化的一般程序 1.?破碎生物组织，并用适当的缓冲液将蛋白质抽提出来；这也就是蛋白质分离纯化的前处理工作。当然如果我们要分析分离的蛋白质存在于细胞的外分泌物中的时候，就无需对生物组织进行破碎处理了，只需要用适当的缓冲溶液将蛋白质抽提出来就行。 2. 用离心法将细胞的亚细胞颗粒（如核、线粒体、微粒体或核糖体）及细胞碎片与溶液分开。 3. 应用盐析法或有机溶剂法将有关蛋白质组分沉淀下来。 4. 进一步应用层析法或电泳法使各种蛋白质分开。 5. 在适当条件下使蛋白质结晶或制成冻干粉。 蛋白质分离纯化中的注意事项： 1.首先要建立一个方便灵敏的分析方法。 2.分离步骤要尽可能少 3.尽量避免蛋白质在提纯过程中的变性：包括六个方面 尽量避免蛋白质在提纯过程中的变性 ▼要求分离流程相当快速，同时分离过程通常要保持在低温（4℃）条件下进行。 ▼尽量避免过度暴露于氧气中 ▼注意重金属离子对酶的失活作用 ▼避免一切过激因素（如过酸或过碱）对蛋白活性的影响 ▼提取液的浓度应维持在较高水平 ▲最后，还需要注意的是：有少数蛋白质需在高离子强度的极性介质中保持活性，因此还需要想提取液中加入KCl、NaCl、(NH4)2SO4 2、等电点沉淀法 　　蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。 3、低温有机溶剂沉淀法 由于有机溶剂自由移动的离子较少，具有较低的介电常数，所以会使溶液的介电常数减小，从而增强偶极离子之间的静电引力，进而使蛋白分子集聚沉淀。另一方面，有机溶剂如果是水溶性的话，本身的水合作用会破坏蛋白质表面的水合层（争夺水分子），也促使蛋白质分子脱水而沉淀。 （二）根据蛋白质分子大小的差别的分离方法 1、透析与超滤 　　透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。　　超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质。 2、凝胶过滤法 　　也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶（Sephadex gel）和琼脂糖凝胶（agarose gel）。 （三）根据蛋白质带电性质进行分离 1、电泳法　　各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳。 原理 聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(Isoelectric Focusing，简称IEF)：利用各种蛋白质pI不同，以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体(carrier ampholytes)，两性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的pH梯度。在电场作用下，蛋白质在此pH梯度凝胶中泳动，当迁移至pH值等于pI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区带。 两性电解质载体(carrier ampholytes) (1)易溶于水，在pI处应有足够的缓冲能力，形成稳定的pH梯度，不致被蛋白质或其它两性电解质改变pH梯度。 (2)在pI处应有良好的电导及相同的电导系数，以保持均匀的电场。 (3)分子量小，可通过透析或分子筛法除去，便于与生物大分子分开。 (4)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，也无变性作用，其化学组成不同于蛋白质。 2、离子交换层析法　　离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；CM-纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。 （四）根据配体特异性的分离方法－亲和色谱法 亲和层析法（affinity chromatography）是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand）的分子能特异而非共价地结合。 亲和沉析法的原理 亲和层析是利用生物分子间所具有的专一亲和力而设计的层析技术。如抗原和抗体，蛋白质A与一些鼠亚类抗体之间，均具有专一的亲和力，在一定条件下能紧密结合成复合物，而这种结合又是可逆的，改变条件可将抗原抗体解离。当把可结合的一对分子的一方(称配体)结合在惰性载体上使其固相化，另一方随流动相流经该载体，双方即结合为一整体。然后设法将它们解离，从而得到与配体有特异结合能力的某一特定的物质。 亲和配体间是如何结合的 是两