酶的生物改造培训讲学.pptVIP

酶的生物改造 ——酶的定向进化研究进展;介 绍 提 纲; 1、酶分子改造的方法;实例：木糖异构酶的定点突变改造; 2、生物自然进化的局限性; 基因工程技术使得人类快速筛选工业菌种成为可能，在几天和数月内即可完成；还可以让人类按照自己的意愿和需要改造菌种，甚至可以产生自然界中原本不存在的全新酶，以适应大工业生产的需要。;3、酶的定向进化技术;4、定向进化的原理;;二、酶定向进化的应用;酶定向进化的典型例子;β－内酰胺酶的活性提高了32,000倍； β－半乳糖苷酶的底物特异性提高了1000倍，且活性提高66倍； 天冬氨酸转氨酶对β－支链氧代氨基酸活性提高105倍且对缬氨酸的催化效率提高2.1×106倍等。;成功的例子;三、酶定向进化的基本过程;1、定向进化的方法;无性进化：易错PCR方法 ;无性进化：易错PCR方法 ;易错PCR方法实例 ;有性进化：DNA改组方法（1994，Stemmer);有性进化：DNA改组方法;有性进化：体外随机重组法（1998，Arnold);有性进化:交错延伸法（1997，Arnold);基因家族的同源重组;The Molecular Breeding directed molecular evolution process; 对一组同源蛋白质的氨基酸序列进行比较，以一 定的标准程序计算出各氨基酸序列的共有序列； 人工合成同序基因后重组表达。 Martin Lehmann等（2000～2002）把这种方法应用在真菌植酸酶家族设计合成了同源植酸酶基因，并表达出具热稳定性的同源植酸酶。;外显子改组;杂合进化;2.基因文库的构建;基因重组： 体外通过DNA连接酶的作用，将基因与载体DNA连接在一起形成重组DNA的过程。 重组方法：黏性末端连接 平头末端连接 修饰末端连接 组装突变基因文库 将重组DNA转入受体细胞或包装成为有感染活性的重组噬菌体的过程。 组装方法：重组质粒载体---转化（原核和真核） 重组噬菌体载体-包装 ;3、基因突变库的筛选方法;平板筛选方法;平板筛选方法;平板筛选方法;荧光筛选方法;2008年诺贝尔化学奖介绍;2008年诺贝尔化学奖介绍;绿色荧光蛋白的应用;绿色荧光蛋白的应用;绿色荧光蛋白的应用;绿色荧光蛋白的应用;绿色荧光蛋白的应用;噬菌体表面展示法;噬菌体显示筛选模式;噬菌体显示的几种类型;M13噬菌体pIII和pVIII的显示;酵母细胞表面展示法;核糖体显示技术;RNA-蛋白质融合技术;RNA-蛋白质的融合;寡霉素与核苷酸的连接;Myc ds-DNA的富集;实例：天冬氨酸转氨酶的热稳定性的定向进化;　高通量筛选方法的建立 　生物信息学技术手段的建立 　天冬氨酸转氨酶热稳定性的改造 ; ;;天冬氨酸转氨酶热稳定性改造;天冬氨酸转氨酶的作用 －－酶法制备L－苯丙氨酸的关键酶 ； ;肉桂酸酶法;结构分析软件Rasmol 分析酶的三维结构;应用DeepView（蛋白质结构预测软件） 确立天冬氨酸转氨酶的热稳定性有关的功能区域;引入随机引物，建立突变基因文库;Compound Library;