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蛋白质组学定量研究常见方法 辉骏生物：/ 免费服务热线：400-699-1663 蛋白质组学定量研究常见方法 1：常规双向电泳 2：DIGE 3：15N等同位素标记 4：ICAT 5：iTRAQ 6：SILAC 辉骏生物：/ 免费服务热线：400-699-1663 1：常规双向电泳 一、双向电泳概述： 双向电泳(Two-dimensional electrophoresis)的基本原理是利用蛋白质的等电点（pI)和分子量(Mr)不同而分离蛋白质：第一向电泳——等电聚焦（Isoelectric Focusing，IEF）根据蛋白质的等电点不同将蛋白质分离，第二向电泳——十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS—PAGE）利用蛋白质的分子量大小不同将蛋白质分离。 双向电泳一次可以从细胞、组织或其它生物样本中分离上千种蛋白质，凝胶上的斑点都对应着样品中的蛋白质，且各种蛋白质的等电点，分子量和含量的信息都能通过质谱鉴定和软件分析获得。因此其在蛋白质组分析、疾病标志物检测、细胞差异分析、药物开发、癌症研究等领域都得到了广泛的应用。 二：双向电泳分离蛋白质混合物具有以下优势： 1、经典方法、应用范围广、适用于各类材料； 2、经济实惠，可大规模多个样本筛选和分析。 辉骏生物：/ 免费服务热线：400-699-1663 1：双向电泳 基于2D的经典定量分析方法。 1、样品准备和定量：抽提对照组和各种不同实验组的蛋白质。 2、蛋白质分离：蛋白质经过2D分离后染色（银染、考染等）。 3、蛋白质的定性与定量分析：通过与对照组相Image Master 7.0分析出实验组中差异点，质谱鉴定差异点蛋白质,同时应用软件分析出其表达量的变化。 2：DIGE DIGE荧光定量方法流程图. 1、样品准备：提取对照组和不同实验组的蛋白质,定量,cy3和cy5交叉标记，同时将所有实验组与对照组的样品等量混合后cy2标记，作为内标。 2、蛋白质分离：等量混合三种荧光素标记后的蛋白质，2D电泳分离，荧光显色。 3、蛋白质定量分析：Image Master 7.0（DIGE)分析同一蛋白质不同处理后的表达量变化。 3：代谢标记法—15N标记法 简介： 在培养基中添加15N，细胞经过若干代培养后，蛋白质将完全被同位素标记，等量混合标记与没有标记同位素的样本、液相色谱和SDS分离，质谱鉴定和定量。 根据质谱谱图中成对峰的面积之比可判断出同一肽段在不同样品中的含量变化，根据二级谱图对肽段进行序列测定从而鉴定蛋白质。 优点： 高效性：15N标记法是体内标记技术，标记效率可高达95%； 重现性：降低由于样品制备不同而造成的实验内差异； 灵活性：在培养基中添加同位素标记15N ，操作方便。 缺点： （1）只有已知蛋白质的氨基酸序列，才可以对14N/15N标记的蛋白质或肽段的相应质量位移进行预测。 （2）由于使用的15N培养基纯度96%，无法完全置换14N,所以15N标记的肽段在质谱中会有额外的同位素峰。 辉骏生物：/ 免费服务热线：400-699-1663 4：化学标记法—ICAT A: ICAT试剂结构，包括3个部分， SH反应集团， biotin标签，同位素臂， 试剂具有两种形式：重型（含8个氘） 和轻型（不含氘） B: ICAT标记定量技术流程，来源不同 处理的蛋白质分别用重型ICAT试剂和 轻型ICAT试剂标记，标记后等量混合， 胰蛋白酶酶切，亲和纯化得到ICAT标 记的多肽，质谱分析，依据MS质谱峰 图强度进行定量，MS/MS鉴定肽段。 4：化学标记法—ICAT ICAT法的缺点： （1）它不能用于标记不含半胱氨酸或半胱氨酸含量低的蛋白质。 （2）ICAT分子量相对较大（约500Da），与蛋白质连接后可能会造成分子的空间位阻 （3）ICAT分子量相对较大（约500Da），由于在MS分析中标签仍保留在每个肽上，使得在碰撞诱导解吸（CID)条件下，很容易被片段化，那么标签特异化的片段离子就会使串联质谱分析标记肽段的过程复杂化， （4） ICAT分子量相对较大（约500Da），这对小肽而言是一个较大的修饰物，会增加数据库搜索的复杂性 （5）标记时通常需要延长时间来保证ICAT与蛋白质充分结合，这可能会造成赖氨酸、组氨