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2013-8-13 1 酶联免疫分析技术 ——ELISA检测 免疫检验  利用免疫检测原理检测与免疫相关的 物质（抗原、抗体、补体、细胞因子 等） 北京世纪坛医院 李莉 免疫检验技术 1.酶联免疫分析技术 2.放射免疫分析技术 3.荧光免疫分析技术 4.化学发光免疫分析技术 5.金标免疫分析技术 6.免疫印迹技术 7.免疫电泳技术等 酶联免疫吸附试验 (enzyme-linked immunosorbent assay ，ELISA)  利用免疫检测原理检测体液中的微量 物质（激素、酶、血浆中的微量蛋白、 药物浓度等） 这些检测结果为临床上确定诊断， 分析病情，调整治疗方案和判断预后 提供有效的实验依据 。 酶联免疫分析技术 是以酶标记抗原/抗体为主要试剂的 一种标记免疫分析技术，利用酶催化 底物反应的生物放大作用，提高特异 性抗原抗体免疫学反应检测的敏感性 . 历史  1971 年 瑞 典 学 者 Engvail 和 Perlmann, 荷 兰 学 者 Van Weerman 和 Schuurs 分 别 报 道 将 免 疫 技 术 发 展 为 检 测 体 液 中 微 量 物 质 的固 相 免 疫 测 定 方 法 ， 即 酶 联 免 疫 吸 附 测 定 法 (enzyme- linked immunosorbent assay , ELISA) 。 Ab Ag和Ab 分离，然后测定Ab Ag或Ab 的量， 2013-8-13 酶联免疫吸附实验的原理 以待测 抗原 （或 抗体 ）与酶 标抗 体（或 抗原 ） 的特异 结合 反应为 基础 ，通 过酶 活力测 定来 确定 抗原（或抗体）含量。 因为 结合 了 免疫 反 应 和 酶催 化 反 应， 所以 是 一种特异而又敏感的技术。 酶免疫技术 Ab*+Ag Ab*Ag+Ab* 异相法： * * * * 从而推算出 Ag量。 A g * 过量Ab * Ab A g * Ab 均相法： Ab *Ag中的标记物*失去特性，直接测定游离 Ab *的量，从而推算出Ag量。 A g * 过量Ab * Ab A g * Ab 1 特异性 抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结 合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高 度的特异性。 测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。 2 2 最适比例 2013-8-13 3 敏感性 化学比色法的敏感度为mg/ml水平 酶反应测定法的敏感度约为5- 10μg/ml 免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿 标记的免疫敏感度可提高数千倍，达 ng/ml水平 例如， HBsAg，其敏感度可达 0.1ng/ml 。 特点      灵敏度高 特异性强 准确性好 试剂稳定 方法简便 酶联免疫吸附实验 方法类型： 酶联免疫吸附实验的 分类 双抗体夹心法（三明志法）原理 固相支持物表面 3 包被抗体 标记抗体 待测物 底物 一步法 ELISA 反应会 出现钩状效应 1.双抗体夹心法（主要用于测抗原） 2.间接法（主要用于测抗体） 3.竞争法（主要用于测小分子抗原 /半抗原和抗体） 4.捕获法（主要用于测血清中某抗体的亚型） 钩状效应（hook effect） 一般情况下的双抗 体夹心法ELISA反应 抗原过量时 2013-8-13 间接法原理 间接法的影响因素 正常血清中所含的 高浓度的非特异性 抗体对间接法的影 包被物 底物 待测物 底物 标记抗体 待测抗体 标记抗原 包被抗体 固相支持物表面 竞争法测抗原的原理 （ 7 ）酶反应终止 液。 固相支持物表面 响 抗原的纯度对间 接法测抗体的影 响 ELISA试剂盒组分： ELISA中有三个必要的试剂： 免疫吸附剂、结合物和酶的底物 。 （1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂 ）； （2）酶标记的抗原或抗体（ 结合物 ）； （3）酶的底物 ； （4）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参考标准 品和控制血清（定量测定中）； （5）结合物及标本的稀释液； （6）洗涤液； 结合物 即酶标记的抗体（或抗原）是 ELISA中关键的试剂 1 酶的催化活性 2抗体（或抗原）的免疫活性 3含有或少含有游离的抗体（或抗原） 4结合物尚要有良好的稳定性。 4 酶标记的抗原或抗体 酶标抗原  天然抗原  重组抗原  合成多肽抗原 酶标抗体  单抗  多抗 2013-8-13 对照设定 阳性对照品 (positive control) 和阴性对照品 (negative contro