优化蛋白质免疫印迹Western Blot教材课程.pptxVIP

优化蛋白质免疫印迹 Western Blot符修estern Blot基本原理Western Blot一般流程Western Blot优化条件的选择定义印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法Western Blot基本原理 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。Western Blot（间接）一般流程: Western Blot可优化条件：1.SDS凝胶的配制和加样2.转移膜的选择3.封闭条件的选择4.抗体浓度的确定5.标记二抗的注意事项6.洗涤条件的改善7.检测方法的选择1.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）不连续的电泳缓冲体系。SDS—蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。 灌制分离胶 隔绝空气加水液封灌制积层胶 插入梳子（1）选择正确的凝胶浓度百分比 按将要检测的抗体对应的原始抗原的分子量大小，计 算出胶的浓度，并算出分离胶各组分的用量。凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度（％）线性分离范围（KD)1512-431016-687.536-945.057-212（2）避免电泳中出现以下情况①条带呈笑脸状 凝胶不均匀冷却，中间冷却不好或电泳系统温 度偏高。②条带呈皱眉状 可能是由于装置不合适，特别是 凝胶和玻璃 挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。③拖尾 样品溶解不好④纹理（纵向条纹）样品中含有不溶性颗粒。⑤条带偏斜 电极不平衡或者加样位置偏斜。⑥条带两边扩散 加样量过多需要注意：（1）凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓，放置加样孔出现不平。（2）拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲。（3）样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度。（4）每个加样孔体积应一致，防止由于体积不同导致不同孔之间的挤压。（5）上样量太大及电压太高都会导致不正常条带的出现。（3）要测定蛋白浓度，且加样量均匀，收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。目前常用比色法测定样品蛋白的含量，Bradford法（考马斯亮蓝法）、Lowry法（Folin-酚试剂法）、 BCA法（二喹啉甲酸法）等。但各有优缺点，可以根据具体情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。其中上样蛋白量不应超过30ug/mm2（载荷面即：如果胶槽是5mm×1mm，则载荷面1mm×5mm=5mm2) 。2.转移膜的选择（1）最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸纤维素（Nitrocellulose，NC）膜和聚偏二氟乙烯 （Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用于核酸杂交。（2）膜的选择主要根据：a.膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）；b.不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）；c.如果后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜。 NC膜与PVDF膜特性： NC膜：NC与蛋白质靠疏水作用结合，无需预先活化，对蛋白质的活性影响小； 非特异性本底显色浅； 价格低廉，使用方便。但结合在NC上的小分子蛋白质在洗涤时易丢失； NC韧性较差，易损坏。PVDF膜：与蛋白质亲和力高，物理强度，以及具有更好的化学兼容性，用前需在甲醇中浸泡，以活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电荷蛋白结合。 三种膜的比较 3.封闭为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。（封闭剂应该封闭所有未结合位点而不替换膜上的靶蛋白、不结合靶蛋白的表位，也不与抗体或检测试剂有交叉反应。）常用的封闭试剂有 ①5%脱脂奶粉或BSA（室温孵育1h）②Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司）③Tween-20的作用：减少非