第二章核酸的结构与性质.ppt

☆ 大片段D.S DNA分子之间比较 片段长短对Tm值的影响较小, 与组成和排列相关 ☆ 小于100bp 的 D.S DNA分子比较 片段愈短， 变性愈快，Tm值愈小 ☆ 变性液中含有尿素，酰胺等 尿素，酰胺与碱基间形成氢键 改变碱基对间的氢键 Tm 值 可降至40℃左右 ☆ 盐浓度的影响 单链DNA主链的磷酸基团 负电荷的静电斥力 两条单链DNA的分离 Na+在磷酸基团周围形成的电子云 对静电斥力产生屏蔽作用 减弱静电斥力 Tm ↑ 当Na+浓度低 屏蔽作用小 斥力加强 Tm ↓ Tm OD A260 静电斥力 熵值（△S） 0.01M 0.1M 1.0M Na+ 当Na+浓度高 屏蔽作用大 斥力减弱 熵值(△S)上升 碱基溶解性降低 疏水作用力增加 pH ~ 12 酮基 → 烯醇基 pH ~ 2-3 NH2 → NH2+ (质子化) 改变氢键的形成与结合力 ☆极端pH条件的影响 一切减弱氢键， 碱基堆积力的因素 均将使Tm 值降低 2.4.2 DNA 分子的复性 (anneal or renaturation) D.S DNA S.S DNA Denaturation ▲ ▼Renaturation 复性过程依赖于单链分子间的随机碰撞 ( Depends on the collision of complementary S.S. DNA ) DNA的复性(renaturation) 复性指变性DNA在适当的条件下，两条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的过程。 退火（annealing）：热变性的DNA经缓慢冷却的复性过程。 影响DNA复性过程的因素 ： ● 阳离子浓度 0.18 ~ 0.2M Na+ 可消除polydNt 间的静电斥力 ● 复性反应的温度 Tm - 25℃ (60-65℃) 以消除S.S. DNA 分子内的部分二级结构 ● S.S. DNA 的初始浓度 C0 单链DNA的浓度（C0） C0高则 碰撞机会大，复性快 ● DNA 分子中, dNt 的排列状况 (随机排列, 重复排列) ● S.S. DNA分子的长度 S.S. DNA愈长 S.S. DNA愈短 → 分子扩散愈慢 → 复性愈慢 → 分子扩散愈快 → 复性愈快 3’-ATCTATGCTGTCAT-5’ 5‘-TAGATACGACAGTA-3’ 5‘-TAGATACGACAGTA-3’ 3’-ATCTATGCTGTCAT-5’ 3’-ATATATATATAT-5’ 5‘-TATATATATATA-3’ 3’-ATATATATATAT-5’ 5‘-TATATATATATA-3’ 5‘-TATATATATATA-3’ 3’-ATATATATATAT-5’ 3’-ATATATATATAT-5’ 5‘-TATATATATATA-3’ DNA分子中的核苷酸的排列重复程度 .重复程度越高.复性越快 2.4.3 核酸的分子杂交 分子杂交(简称杂交,hybridization)是核酸研究中一项最基本的实验技术。其基本原理就是应用核酸分子的变性和复性的性质,使来源不同的DNA(或RNA)片段,按碱基互补关系形成杂交双链分子(heteroduplex)。杂交双链可以在DNA与DNA链之间,也可在RNA与DNA链之间形成。 杂交探针(probe) 在进行分子杂交技术时，要用一种预先分离纯化的已知RNA或DNA序列片段去检测未知的核酸样品。作为检测工具用的已知RNA或DNA序列片段称为杂交探针(probe)。它常常用放射性同位素来标记。 探针必须用能够检测的试剂所标记。标记主要有放谢性同位素和非放谢性同位素系统。 RFLP分析中所用的探针，通常为某一DNA片段，其长度一般为0.5-2.5 kb。 Southern印迹杂交 1975年，英国Southern创建 Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量 。 Southern 杂交主要步骤 待测DNA样品的制备、酶切 待测DNA