复旦大学—遗传学 .ppt

什么是遗传工程？ 体外DNA重组技术：利用工具酶将外源片段和载体连接，导入生物体并使其稳定复制和传代的技术 目的 研究工作 生物产品(生物反应器) 改良物种(提高品质) 基因治疗 工具酶 A. 剪切酶类 有目的有选择的把目的片段切开 B. 连接酶类 将目的片段和载体相连 C. 其他工具酶 修饰, 加工等作用 同切酶和同粘酶 同切酶: 识别相同的位点, 但生成不同的末端. 同粘酶: 识别不同的位点, 但产生相同的粘性末端 连接酶及其对底物的要求: T4 Ligase, Ecoli Ligase 载体及其构成基本要素 能独立复制并稳定传代:复制起始点ori或自主复制序列ARS和着丝粒, 端粒 方便插入外源片段: 单酶切位点 选择标记: 药物抗性 报告基因: 插入筛选标记 易分离提取 高产率（多拷贝） 强启动子 多宿主 常用载体 质粒(plasmid)，粘粒(cosmid)，噬菌体，噬粒(phagemid), 病毒，PAC，YAC，BAC 常用宿主 大肠杆菌: 繁殖快, 易培养, 易分离产物 噬菌体: 转化效率高, 易于保存 酵母: 繁殖最快的真核生物, 适于有蛋白质加工的基因表达 如何提高克隆效率? 提高插入片段和载体的比例 尽可能采用粘端连接* 载体脱磷以降低载体自连 插入片段磷酸化 改进转化条件 问题: 有一外源片段用某种酶切,生成了5′ 突出粘性末端　 5′ -GATC, 但是载体上的单酶切位点只能生成下面这几种粘性末端: 5′-CTAG 5′-TCGA 5′-TTAA 应当采用怎样的策略来提高连接效率? 不依赖于内切酶和连接酶的体外重组 位点专一性重组 （依赖于短片段同源序列的重组） 筛选DNA文库 用标记的核酸作为探针 用诱饵质粒筛选表达cDNA文库 探针标记 标记物： 同位素标记：32P 非放射性标记：荧光标记，生物素，dig(地高辛）等 PCR技术及其应用 应用范围： 检测和诊断（高灵敏度） 基因克隆（eg: 通过部分已知序列扩增未知目标片段 其他常用分子生物学技术 丙烯酰氨凝胶电泳（PAGE） 脉冲电泳 双向电泳 Southern杂交 northern杂交 western杂交 转基因动植物和基因治疗 转基因动物：医学研究，生物制药 转基因植物：改良品质，提高抗逆能力 基因治疗：治疗药物无法根治的遗传性疾病 Lambda噬菌体载体及工作原理 合成cDNA的一般原理 如何产生一群有方向性的cDNA，必要性（表达需要），原理，限制性内切酶对甲基化的敏感性产生对位点的选择性作用 探针的标记 Cosmid结构和工作原理 用标记探针筛选DNA文库的流程 随机引物标记法 变性 模板DNA 随机6核苷酸引物， dNTP, 某种标记dNTP DNA Pol I 5‘ 随机引物 标记的DNA片段 Synthesize Radioactive PROBE Purified templete Klenow, random primer probe REMOVE REMOVE Inserted DNA coding Protein for detection GAL4-AD lacZ bait DNA Inserted DNA coding Protein for detection GAL4-AD lacZ bait DNA Bait DNA Bait DNA 5′???C A U G???3′?????mRNA3′???G U A C???5′?????Antisense RNA 强调磷酸基团的位置，以及对 后续工作的影响 强调，几乎所有DNA酶作用都需要Mg++存在 介绍每一种酶的特性和作用，以及可能用到的地方 一个质粒的基本结构 标准的YAC载体及其克隆位点 BAC载体的优越性：携带片段大且稳定，单拷贝不易发生非同源重组，提取方便（普通碱裂解法），宿主繁殖快 耐受性，指对外源片段产物毒性的耐受力 突变率低：可以通过筛选突变型细胞株降低可能发生的重组，突变等事件，使得外源片段稳定传代 分别介绍每种宿主的优缺点和适用范围 一个标准的克隆外源片段过程 显色反应的平板，白色菌落为有插入片段的克隆 前3项为连接条件的改善，简述单分子反应和双分子反应的反应动力学，说明操作原理，举例说明人为设计的拈端连接方法和 末端转移酶的使用；脱磷的使用限制（一般PCR产物不能用载体脱磷方法） 最后一项为转化条件的改善，感受态细胞制备以及热激或电击，或PEG介导的原生质体转化（对酵母系统） 采用部分填平法造成2碱基的匹配粘性末端 高效，精确，特别适合大片段分子的重组。 PHAGEMID的结构和工作原理 * * 第十一章 遗传工程 利用转基因手段对生物进行人为改造的技术 限制性内