欧蒙印迹法检测ANA抗核抗体 实验报告.docVIP

PAGE2 / NUMPAGES2 实验1：抗ANA自身抗体的检测（欧蒙斑点法） 一、实验目的及原理 抗核抗体（antinuclear antibody，ANA）是一组针对细胞核成分的自身抗体。ANA阳性提示患有自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、混合性结缔组织病、干燥综合症、全身性硬皮病、原发性胆汁性肝硬化等。 根据细胞内各分子的理化特性和分布部位，ANA可分为抗DNA抗体、抗组蛋白抗体、抗非组蛋白抗体、抗核仁抗体和抗其他细胞成分抗体。 在本实验中，抗核抗体谱（IgG）检测试剂盒（欧蒙印迹法）的检测模条上平行包被了高度纯化的自身抗原。用于体外定性检测人血清或血浆中的抗nRNP/Sm、Sm、SS-A（天然SS-A和Ro-52）、SS-B、Scl-70、PM-Scl、Jo-1)CENPB、PCNA、dsDNA、核小体、组蛋白、核糖体P蛋白和AMAM2共14种不同抗原IgG类抗体。 欧蒙印迹法的实验原理如下：样本血清与包被抗原的检测膜条温育，如果标本为阳性血清，则血清中的自身抗体将与膜条相应位点上的自身抗原特异性结合。洗膜后添加碱性磷酸酶（AP）标记的羊抗人IgG（二抗），将与结合在膜条相应抗原位点上的自身抗体（一抗）结合，形成抗原-1st Ab-2nd Ab复合物。最后，加入酶底物 NBT/BCIP（四唑硝基苯胺兰/5-溴-4-氯啶-磷酸盐）显色，阳性血清在对应膜条抗原条带处原位可形成蓝紫色的化合物沉淀。 二、实验材料 包被抗原的检测膜条 nRNP/Sm、Sm、SS-A、SS-B、Scl-70、PMScl、Jo-1、CENP B、PCNA 、dsDNA、核小体、组蛋白、核糖体P蛋白 阳性对照：人IgG，100 倍浓缩，1x0.02ml 酶结合物：碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG，10倍浓缩，1x3ml 样本缓冲液，直接使用，1x100ml 清洗缓冲液，10 倍浓缩，1x 50ml 底物液：NBT/BCIP（四唑硝基苯胺兰/5-溴-4-氯啶-3-吲哚-磷酸盐），直接使用，1×30ml 温育盘2x8槽 三、实验步骤 （一）预处理 试剂盒平衡至室温30分钟后使用，取出膜条。 清洗缓冲液， 10倍稀释：30mL 清洗缓冲液+270mL DW，50ml/支分装。 血清样本，使用前101X稀释：No.1666血清 210uL +21mL 样本缓冲液→10mL/支，分装2支；按排一组作阳性对照： 0.02ml 阳性对照+2ml 样本缓冲液。 AKP-羊抗人IgG，使用前10倍稀释：AKP-羊抗人IgG 2.1 mL + 18.9mL样本缓冲液→10mL/支，分装2支。 （二）正式处理 预处理5min 用镊子取出膜条，数字面朝上放入温育槽中，每槽中加入1.5ml 样本缓冲液；常温 摇床震荡5min。 抗原和血清（1st抗体）温育30min 枪头吸去槽内液体，在温育槽中分别加入1.5ml 已稀释血清，常温，摇床震荡30min。 清洗15min 用枪头吸去槽内液体，在摇摆摇床上用1.5ml 清洗缓冲液清洗膜条3次，每次5 min。 加10X稀释的酶结合物（二抗），抗原-抗体-羊抗人IgG（二抗）温育30min 吸去槽内液体，在槽内分别加入1.5 ml 酶结合物。常温 摇床震荡30min。 清洗15min 用枪头吸去槽内液体，在摇摇床上用1.5ml 清洗缓冲液清洗膜条3次，每次5 分钟。 加底物溶液，反应10min 吸去槽内液体，在槽内分别加入1.5 ml 底物液。常温，摇床震荡10min。 蒸馏水终止反应 吸去槽内液体，用蒸馏水清洗3 次，1.5ml/次，1?/次。风干15 min。 （三）判读结果 膜条干后，肉眼观察条带颜色强度；对照膜条上包被抗原位置，决定阳性抗体的种类。 质控带出现强的颜色反应说明实验操作正确。膜条包被抗原的位置上出现的白色条带应判为阴性；阳性反应在抗原包被区呈兰色或紫色条带。 抗原带着色与质控带强度相同为强阳性、中到较强为阳性、非常弱为可疑、无色为阴性。 四、实验结果 第8组条带如图1所示（从左至右数第一列）。结果判读示意图如图2所示。 图1. 本次实验膜条条带 图2. 结果示意图 根据结果示意图，本次实验在质控带上出现了深紫色条带，位于从上往下数的第一区域，说明实验操作正确。 本组膜条上出现强阳性的条带有三条，分别位于从上往下数的第二区域（1条）和第九区域（2条），条带呈深紫色。对照结果示意图，说明本实验所用患者血清的抗SS-A、抗Ro-52以及抗核糖体P蛋白抗体为强阳性。 膜条上出现弱阳性的条带有一条，位于从上往下数的第八区域，条带呈淡蓝色。对应结果示意图，可知本实验所用患者血清的抗SS-B抗体为弱阳性。 另外，膜条从上往下数第四区域出现一条白色条带，所对应检测的抗体为抗dsDNA