鸭坦布苏病毒taqman荧光定量pcr方法的优化.pdfVIP

第 35卷 第4期 中 国 预 防 兽 医 学 报 VO1．35．No．4 2013年 4 月 ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicine Apr． 2013 doi：10．3969~．issn．1008-0589．2013．04．10 鸭坦布苏病毒 TaqMan荧光定量 PCR方法的优化 彭 珊 ，闫丽萍 ，李国新 ，李雪松 ，滕巧泱2，肖亚莉 ，何文兴 ，李泽君 (1．济南大学 化学化工学院，山东 济南 250022；2．中国农业科学院上海兽医研究所 禽病实验室，上海 200241) 摘 要：为提高鸭坦布苏病毒(DTMUV1TaqMan荧光定量PCR方法的敏感性和简化反应条件，本研 究在前 期建立的TaqMan荧光定量 PCR方法的基础上，设计一条特异性的反转录引物，优化反应体系，建立了简便、快 速、敏感的 TaqMan荧光定量 PCR方法。该荧光定量 PCR方法最低检测限为 10拷贝，敏感性是未优化的荧光定 量 PCR方法的5倍、是普通 PCR方法的 100倍，并且该方法对 DT Ⅳ 的最低检测限是 0．O1半数鸡胚致死量 (ELD )。通过批内和批间实验的变异系数表明优化的荧光定量PCR方法的重复性比未优化的荧光定量PCR方法 好。通过该优化的荧光定量PCR方法检测其它常见的鸭病病毒的DNAs或RNAs，证明了该方法特异性好。对现 地6O份疑似 DTMUV的样品进行检测，用该方法检 出57份样品为阳性，明显高于普通PCR，并且在区分35Ct 值左右样 品试验 中敏感性优于未优化的荧光定量PCR方法。该优化的DTMUVTaqMan荧光定量 PCR方法更适 用于DTMUV的快速定量流行病学诊断。 关键词：鸭坦布苏病毒；荧光定量PCR；TaqMan荧光探针 中图分类号：$852．65 文献标识码：A 文章编号2013)04．0294．05 OptimizationofTaqMan--basedreal-t·imePCR assayfor detectionofduckTembusuvirus PENGShan，YANLi—ping：，LIGuo-xin，LIXue-song：，TENGQiao—yang：， XIAOYa—li，HEWen-xing，LIZe-jun (1．CollegeofChemistryandChemicalEngineering，Ji’nna University，Ji’nna 250022，China； 2．AvianDiseasesLaboratory，ShnaghaiVeterinaryResearchInstitute，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Shnahgai200241，China) Abstract：ToestablishasensitivitymethodforthedetectionofhtenewlyemergedduckTembusuvires(DTMUV)，an optimized TaqMan real—timePCR assaywasdeveloped and by usingaspecificreversetranscripdon primerand na optimized reactionbufferbasedpreviousTaqManreal-timePCR assay．Thedetection limitofhteoptimizedreal-timePCR assaywas10 copies，htesensitiviyt ofhtisassaywas5timeshtna non—optimizedreal—timePCRassay，nadsensitivewas100timeshtanthe conventionalPCR．ForhteDTMUV．htedetectionlimitoftheoptim