2 细胞生物学实验技术.pptxVIP

第二章细胞生物学实验技术;;;;1. 构成： ①照明系统 ②光学放大系统 ③机械装置 2. 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成虚像。;3. 分辨力R：指分辨物体最小间隔的能力。 R=0.61λ/N．A． λ为入射光线波长； 镜口率 N．A． ＝ｎsinα/2， n=介质折射率； α=镜口角（样品对物镜镜口的张角） 思考：如何提高显微镜的分辨能力？;几种介质的折射率;（二）荧光显微镜 Fluorescence microscope;分色镜：反射和透射;Fluorescence image of epithelial(上皮) cell, DNA in blue and Microtubules in green;（三）激光共聚焦扫描显微境 Laser confocal scanning microscope, LCSM;laser confocal scanning microscope, LCSM;LCSM Image of a Xenopus（非洲爪蟾 ） Melanophore（载黑素细胞） microtubule cytoskeleton (green) and the nucleus (blue);;（四）暗视野显微镜 dark field microscope;普通光学显微镜看不见未染色的组织、细胞和细菌、病毒等活机体的图像，因为通过样品的光线变化差别（反差）很小。 标本染色后改变了振幅（亮度）和波长（颜色），影响了反差而获得图像。但是染色会引起样品变形，也可使有生命的机体死亡。要观察不染色的新鲜组织、细胞或其他微小活体必须使用位相显微镜。 在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。 环形光阑（annular diaphragm）：位于光源与聚光器之间。 相位板（annular phaseplate）：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。;相位板上的环形光阑;用途：观察未经染色的玻片活体标本;（六）微分干涉差显微镜 Differential interference contrast microscope （DIC）;（七）倒置显微镜 inverse microscope ;（八）当代显微镜的发展趋势;二、电子显微镜;以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的波长短，并且波长与加速电压(通常50~120KV)的平方根成反比。 由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。 分辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍。 用于观察超微结构（ultrastructure），即小于0.2μm、光学显微镜下无法看清的结构，又称亚显微结构（submicroscopic structures）。;透射电子显微镜;不同光线的波长;2、制样技术;2）冰冻蚀刻 freeze-etching;20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构。 分辨力为6~10nm，由于人眼的分辨力（区别荧光屏上距离最近两个光点的能力）为0.2mm，扫描电镜的有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000X。;Scanning electron microscope（ SEM）;工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。 为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。;扫描电子显微镜原理;人类红细胞;酵母;人类精子;三、显微操作技术micromanipulation technique;显微操作仪;第二节 生物化学与分子生物学技术;组织化学和细胞化学染色方法（histochemical and cytochemical staining method）用于对某些细胞成分进行定性和定位研究。 （一）固定 物理固定：血膜空气快速干燥、冷冻干燥。 化学固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和锇酸等试剂。显示多糖常用乙醇固定，显示酶类多用甲醛丙酮缓冲液固定。;（二）显示方法;二、免疫细胞化学 immunocytochemistry;三、放射自显影术;四、分子杂交技术;（二）Southern杂交;六、PCR 技术;PCR原理;第三节 细胞分离技术;一、离心技术;（一）差速离心 Differential centrifugation;Low speed;（二）密度梯度离心;1、速度沉降 velocity sedimentation ;2.等密度沉降 isopycnic sedimentation;Velocity (A) and Equil