2 基因克隆载体99.pptx

第二章 基因工程的基本条件;二、基因克隆载体;（一）载体的功能及特征;载体的功能：;载体应具备的条件：;基本概念：;The genomic DNA of E.coli: a single circular double-stranded DNA, with the contour length about 850 times longer than the cell;4）绝大多数的天然DNA质粒具有共价、闭合、环状的双链结构(covalently closed circular DNA, cccDNA)，以超螺旋形式存在。;7）最大装载量：15 kb（5%）。;质粒不是单纯的寄生，携带的遗传信息赋予细菌特定的遗传性状，如抗生素抗性基因Ampr。;质粒的基本特征：;1、自主复制性;严紧型质粒; 1-3拷贝/cell，复制受细胞核控制，伴随染色体DNA复制而复制。; 加入氯霉素（终浓度10-170?g/ml）抑制细菌蛋白质合成后，可达3000拷贝/cell 。;2、不相容性(incompatibility);分子机制：; 两种含相似复制子结构的不同质粒，在复制时受同一拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。 ;不相容性的质粒组成不相容性群，如：;3、可转移性; 除带有自我复制所必需的遗传信息外，还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。;; 值得注意的是，某些非接合型质粒（如ColE1）在接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由 bom和mob基因决定。; 4、携带特殊的遗传标记;质粒的空间构型：;质粒空间构型与电泳速率：;质粒的分类 ;1）F质粒：;R质粒：;Col质粒：;接合型质粒;3、按复制机理： ;4、按分子量大小：;质粒的构建;如：天然质粒pSC101分子量9.09kb，只有1个EcoR I切点充当克隆位点，筛选标志只有Tetr。; 可通过插入失活筛选，但免疫筛选E1的操作非常麻烦。; 大于20kb的质粒很难导入受体细胞，且极不稳定。; 灭活对质粒复制产生负调控效应的基因，提高质粒的拷贝数。; 最好有两种选择标记基因，并且在选择标记基因区内有合适的克隆位点。;氨苄青霉素抗性（ampicillin, Ampr） 卡那霉素抗性（kanamycin, Kanr） 四环素抗性（tetracycline, Tetr） 链霉素抗性（streptomycin, Strr） 氯霉素抗性（chloromycetin, Chlr）;3）在选择标记基因内，引入人工合成的多种限制酶连续酶切位点的DNA短序列，???多克隆位点(multiple cloning sites, MCS)，也称多酶接头(polylinker)。 ;4）根据外源基因克隆的不同要求，分别加装特殊的基因表达调控元件。;实验室用质粒多以少数几个野生型质粒为基础构建：;人工构建的质粒根据其功能和用途，分为： ;1、高拷贝质粒：;如：pBR322： ; ; ;4、测序质粒：;如：pUC18/19：;pUC18/19正选择标记lacZ’的显色原理:;; ;6、穿梭质粒(shuttle plasmid)：;E.coli--Pichia.pastoris穿梭质粒;;7、表达质粒：;pGEM-3Z：;;; 只有含启动子或终止子的外源DNA插入载体的合适位点，报告基因才能表达，表达量的高低直接反映表达调控元件的强弱。;质粒DNA的分离纯化;氯化铯密度梯度离心法 ;沸水浴法 ;碱裂解法;氯化铯密度梯度离心法 ;（三）噬菌体或病毒DNA;;噬菌体吸附在E.coli上;T4噬菌体;The DNA is about 3,500 times longer than the viral particle.; ;E.coli的?噬菌体DNA;cos位点对包装至关重要。;;溶菌周期;1、溶菌周期：;2、溶源周期：; 经过若干世代后，才从细菌染色体上脱离下来，复制、合成噬菌体蛋白，组装成新的噬菌体，导致菌体细胞裂解。; ?噬菌体感染E.coli后，除能裂解细胞（溶菌状态）外，还能将其DNA整合到宿主细胞染色体DNA上，而不产生子代噬菌体颗粒，即溶源状态。; 整合由?-DNA上cI和int基因的产物激活，这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质。;DNA重组技术需?噬菌体进入 状态。;感染早期：双链进行?型复制。;?-DNA载体的构建; 缩短野生型?-DNA长度，可提高装载量。