试验中常见问题及解答.docxVIP

试验常见问题及解答 一、结果常见问题分析 弱/无信号 样品中I1PV DNA的含量很低。 确保PCR产物完全变性成单链，如有必要，在使用前再次变性PCR产物。 IC及HPV分型阳性点不显色（如右图） 可能是因为DNA模板中存在抑制PCR反应的抑制物质，首先, 通过抽提得到的DNA的纯度对PCR反应会有很大影响,所以必 须在做PCR模板的时候将其稀释从而降低DXA溶液中抑制剂的浓度，使得PCR反应能正 常进行，在一家新的医院开始试验的时候均需要摸索本院样本自身的特点。 或者所取样本，不符合凯普HPV分型检测说明书中对样本的要求，样本之前经过碘染 色或者病人使用了阴道冲洗药物，均会对PCR反应产生抑制。 确保PCR产物完全变性成单链，如有必要，在使用前再次变性PCR产物。 如果这些情况的时候，建议对样本稀释10倍重新PCR,然后杂交，结果仍然不成功的 情况下，建议按照凯普说明书要求重新収样检测。 IC点弱/不显色，但HPV分型阳性点显色（如右图） 由于IC和HPV DNA之间存在竞争，高浓度的HPV DNA可能会对IC 点的扩增反应产生竞争性抑制,此现象出现时如HPV分型点显色正常， 则认为分型结果正确。 Biotin点不显色 请确认所使用试剂是否仍在有效期内。尤其是酶标液及显色液是否按要求使用及储 存。 确定实验操作是否严格按照说明书进行、试剂是否按要求保存使用。 阴性对照显现HPV分型阳性点 PCR试剂可能被污染，収5 |11 PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。 重复进行PCR及杂交试验。 杂交膜出现很高的背景 可能rti于封闭不足，使未结合的酶标残留在膜上。确保封闭液完全覆盖整个杂交膜。 也可能因为没有完全将未结合的试剂清洗干净，请确保在显色过程中杂交膜充分清 洗，无剩余残留液体。 杂交结果中IC点不清楚，同时阳性点也不清楚或者比较淡； 可能原因：①杂交温度控制不当，出现非特异性杂交点； 样本IHPV病毒DNA的浓度本身含量就很少； DNA样本屮有对PCR反应的抑制物质，影响了 PCR扩增的效率； 解决方法：将DNA样本稀释10倍后，重新进行PCR扩增及杂交反应。 杂交结果中IC点没有，同时阳性点淡而且不清楚； 可能原因：①样本中含有抑制PCR反应的物质； 样本IHPV DNA浓度较低，同样本中含有抑制PCR反应的物质； 病人样本不符合凯普分型试验要求，样本本身为阴性结果，但因为 样本中有抑制PCR反应的物质，同时操作人员对杂交温度又控制不当, 出现非特异性杂交点； 解决方法：增加用于扩增DNA浓度，重新进行PCR扩增及杂交反应。 封阻液抽不动 可能原因：①仔细观察封阻液是否有絮状微生物或澄淀，如果有则证明封阻液有发霉 迹彖，是由于操作中没有使用灭菌枪头而造成的。 重新购买封阻液，同时确保试验屮使用已灭菌的移液枪头 什么时候需要做阳性及阴性对照； 当一个新的医院，一个新的地方开展试验的时候，或更换试验地点的时候，需要进 行阴阳性对照试验； 当使用的检测试剂批次改变的时候需要做1次阴阳性对照； 当杂交结果出现令人疑惑，比如多个样本的杂交结果一样，或者杂交结果出现过多的 多重感染，以及杂交试验后出现许多无IC点及阳性杂交点的结果等情况下，需要使用 同批试剂进行阴阳性对照试验以验证问题所在； 导流杂交试验中的污染主要会出现在那一步中，应该怎样防范？ 首先，污染情况主要由PCR操作中样本DNA的交叉而产生；对于此种情况，应严格按 照S0P操作，确保PCR加样的试验器材均为专用，特別是移液枪和枪头。 其次，杂交结果中出现的比较弱的杂交点不是污染造成，而是杂交温度不符合要求而 造成的非特异性点。对于此种情况，应在杂交操作的时候，确保杂交液的45°C条件，以及杂交仪的温度是否符合说明要求的误差范圉显示。最终结果如果出现杂交点较弱的情 况（肉眼很难看出），此点可以不用判读。 杂交后的杂交膜没有形成均一的杂交边缘，而且出现同一次杂交结果互相污染的现象。 可能原因：在放分隔膜的时候没有放好，没有形成每个样本 独立的杂交空间，所以出现了杂交膜Z间的互渗、反渗以及下 渗现象； 解决方法： O O M 互渗现象：以9孔为例，在进行预杂交的吋候，首先要将杂交膜上的残留溶液全部抽 干净，然后先将杂交液加入孔1、3、5、7、9,观察杂交膜2、4、6、8, 1?2分钟后如 果朵交膜2、4、6、8没有出现润湿或者杂交膜表面出现水珠现象（注意杂交膜边缘）， 则无互渗现象，如果出现了互渗现象在重新安装分隔硅胶、分隔室及压扣盖，再进行互渗 现象试验，如果仍然有此现象出现，则即使联系厂家更换分隔硅胶。 反渗现象：预杂交结束后，开泵将预杂交液完全抽干，然后继续开着泵抽1?2分钟, 关泵，等待1?2分钟，再加PCR产物及杂交液，将会减少反渗现象。 下渗现象：在确保