二、α-淀粉酶活力的测定2010.pptVIP

生物技术专业系统实验（四） ——酶（蛋白质）工程实验II 二、α-淀粉酶活力的测定 --国家标准GB 8275-2009 1.目的意义 2.实验原理 3.试剂和溶液 4.仪器和器材 5.实验方法 6.实验报告 7.思考题 1.目的意义 淀粉是葡萄糖以α-1,4糖苷键及α-1，6糖苷键连结的高分子多糖，是人类和动物的主要食物，也是食品、发酵、酿造、医药、纺织工业的基本原料。 淀粉酶(amylase)是能够水解淀粉分子链中的α-1,4糖苷键，将淀粉链切断成为短链糊精、少量麦芽糖和葡萄糖，是淀粉粘度迅速下降的酶制剂。包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。它们广泛存在于动物界、植物和微生物界。 除特殊的外，一般淀粉酶对于生的淀粉不起作用，只作用于糊化后的淀粉。不同来源的淀粉酶，性质有所不同。其中最重要的淀粉酶是α-淀粉酶。 3D Structural of an α-Amylase α-淀粉酶是淀粉及以淀粉为材料的工业生产中最重要的一种水解酶，其最早的商业化应用在1984年，作为治疗消化紊乱的药物辅助剂。 α-淀粉酶对淀粉的分解作用是工业上利用淀粉的基础，如纺织工业上的退浆；酶法糖化制造葡萄糖、麦芽糖；酶法制造酒精、料酒等。 例如，生产葡萄糖需要葡萄糖淀粉酶，但仅有葡萄糖淀粉酶作用，不能液化淀粉溶液，葡萄糖的生成速度非常慢。此时，α-淀粉酶的使用就成为必要条件。 α-淀粉酶的活性测定，在理论研究和实际应用中具有重要的意义。 通过本实验，学习一种测定α-淀粉酶酶活力的方法，巩固并熟练分光光度计的使用方法。 2.实验原理 α-淀粉酶能够将淀粉分子中的α-1，4糖苷键随机切成长短不一的短链糊精、少量麦芽糖和葡萄糖，而使淀粉对碘的呈蓝色特性反应逐渐消失，呈现棕红色，其颜色消逝的速度与酶活性有关，可以用来表示淀粉酶水解的程度，因而能购通过反应后溶液的吸光度值衡量酶的活力。 3.试剂和溶液 3.1 原碘液 称取2.2g碘和4.4g碘化钾完全溶解后定容至100ml，储存于棕色瓶中（教师准备）。 3.2 稀碘液 吸取原碘液2ml，加20g碘化钾用水溶解并定容至500ml。 3.3 可溶性淀粉溶液 称取2.000g（精确到0.001g）可溶性淀粉于烧杯中，加适量蒸馏水调成浆糊状物，边搅拌边加入沸水90ml，搅拌加热至完全透明冷却后定容至100ml，现配现用。 3.4 磷酸缓冲液（pH6.0） 4.52g磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）和0.8g柠檬酸（C6H8O7·H2O），定容至100ml。pH计校正后使用。 3.5 盐酸溶液（0.1M/L） 100ml 4. 仪器及器材 4.1 仪器 电子天平 2台 　 恒温水浴锅 每组 1台　 　 分光光度计 每组 1台 记时器 每组 1台 3.2 器材（每组） 15ml大试管10支 5ml移液管10支 1ml移液管5支 10ml移液管10支 比色皿1套（4个） 双蒸水1瓶（50ml） 洗瓶1个 玻璃平皿1套 50ml小广口瓶（棕色）2个 50ml 容量瓶 1个 100ml 容量瓶 1个 500ml 试剂瓶2个 100ml 试剂瓶2个 250ml 三角瓶2个 200ml烧杯2个 500ml烧杯1个 记号笔1支、吸耳球、称量纸、药勺、试管架、研钵、纱布 5.实验方法 — GB 8275-2009法 将淀粉作为底物，通过比色法测定碘显蓝反应色值的减少以测定α-淀粉酶活力的方法。 5.1 分析方法 5.1.1 待测酶液的制备 精确称取1g酶粉，用少量pH6.0磷酸缓冲液充分溶解，将上清小心倾入容量瓶中，若有剩余残渣，再加少量磷酸缓冲液充分研磨，最终样品全部移入容量瓶中，用磷酸缓冲液定容至100ml，摇匀。四层纱布过滤，滤液放置于4℃冰箱待用。 使用前 倍稀释。 5.1.2 测定 A液：吸取20ml可溶性淀粉溶液于试管中，加入磷酸缓冲液5ml，充分混匀后，置于60 ℃恒温水浴中预热5min B液：将1ml稀释好的待测酶液加入A液，摇匀，立即计时，准确反应5min C液：将0.5ml 0.1mol/L盐酸和5ml稀碘液加入试管中，摇匀待用 立即用移液器吸取1mlB液，加入预先盛有C液的试管中，摇匀 同时设置空白组（以1ml磷酸缓冲液取代1ml稀释酶液） 于660nm波长下，用10mm比色皿迅速测定其吸光度值（A） 根据吸光度表C1，查得所测酶液的酶活力 5.1.3 计算酶活力