克隆文库的构建及其在微生物分子生态学中的应用.pptVIP

D:重组DNA的转化和克隆 将cDNA与载体连接成的重组DNA导入到受体菌菌群中储存，每个受体菌都含有一段不同的cDNA。如果用到的载体为噬菌体时，含有cDNA的重组噬菌体还需要经过体外蛋白质外壳包装反应，才能成为具有侵染和复制能力的成熟噬菌体。 E:筛选鉴定cDNA 当获得了含重组DNA的宿主细胞时，即完成了基因的克隆。利用适当的鉴定和筛选方法，就可以从中找到携带所需要的目的基因片段的重组克隆体。 1.3 16SrDNA、18SrDNA文库 2.克隆文库的筛选和鉴定 2.1抗生素抗性，挑选出含有质粒的克隆。 2.2蓝白斑筛选，挑出带有插入片段的克隆。 2.3核酸杂交 2.4特异性免疫学检测 设计适用于蓝白斑筛选的基因工程菌为β-半乳糖苷酶缺陷型菌株。这种宿主菌的染色体基因组中编码β-半乳糖苷酶的基因突变，造成其编码的β-半乳糖苷酶失去正常N段一个146个氨基酸的短肽（即α肽链），从而不具有生物活性，即无法作用于X-gal产生蓝色物质。用于蓝白斑筛选的载体具有一段称为lacZ的基因，lacZ中包括：一段β-半乳糖苷酶的启动子；编码α 肽链的区段；一个多克隆位点(MCS)。MCS位于编码α肽链的区段中，是外源DNA的选择性插入位点。虽然上述缺陷株基因组无法单独编码有活性的β-半乳糖苷酶，但当菌体 蓝白斑筛选 中含有带lacz的质粒后，质粒lacz基因编码的α肽链和菌株基因组表达的N端缺陷的β-半乳糖苷酶突变体互补，具有与完整β-半乳糖苷酶相同的作用，在诱导剂IPTG的作用下可以使X-gal生成蓝色物质的能力，这种现象即α-互补。当外源DNA（即目的片段）与含lacz的载体连接时，会插入进MCS（即靶基因），使α肽链读码框破坏，这种重组质粒不再表达α肽链，将它导入宿主缺陷菌株则无α互补作用，不产生活性β-半乳糖苷酶，即不可分解培养基中的X-gal产生蓝色，培养表型即呈现白色菌落。 最常用、最可靠的方法之一。可大规模地分析文库的克隆子。核酸杂交的主要步骤是核酸分子的变性和选择性退火。双链DNA或处于二级结构的RNA分子被变性回复到它们原来单链、线性的形式，从而使它们处于能与互补的核苷酸链退火杂交的状态。双链DNA采用碱(如NaOH)或高温处理变性，RNA分子则通常是在甲酰胺存在的情况下通过加热使之变性。互补的核苷酸链通常是外部加入的与母板RNA序列互补的DNA链与母板DNA互补的DNA或RNA链。外部加入的互补链若事先被标记，则可以作为探针从核酸混合物中检测到与之杂交的特定的目标核酸序列。而且由于氢键的微弱性，互补的单链核苷酸分子经退火而形成核酸双链分子的过程是可逆的。 核酸杂交 特异性免疫学检测 在cDNA表达文库中，目的基因的表达产物能与特异性抗体发生免疫学反应，通过酶学的方法加以检测。 3.克隆文库在微生物分子生态学中的应用 3.1 微生物分子生态学的概念 3.2 克隆文库在分子生态学中的应用 3.1 微生物分子生态学的概念 微生物分子生态学是研究生态环境中微生物与其周围生物以及微生物与环境之间相互关系的学科。它主要以微生物基因组DNA的序列信息为依据，通过分析样品中DNA分子的种类和数量来反映微生物区系的组成和群落结构及其变化，进而研究微生物与生物环境、微生物与非生物环境之间的相互关系及其分子机制。 3.2 克隆文库在分子生态学中的应用 3.2.1 标记核酸探针杂交技术应用 3.2.2 16SrRNA/rDNA、18SrRNA/rDNA序列分析技术 3.2.1 标记核酸探针杂交技术应用 原位荧光杂交技术(FISH)是根据已知微生物不同分类级别上种群特异的DNA序列，以利用荧光标记的特异寡聚核苷酸片段作为探针，与环境基因组中DNA分子杂交，检测该特异微生物种群的存在与丰度。该方法的特点是可以进行样品的原位杂交，应用于环境中特定微生物种群鉴定、种群数量分析及其特异微生物跟踪检测，是目前在微生物分子生态学领域应用比较广泛的方法之一 3.2.2 16SrRNA/rDNA、18SrRNA/rDNA序列分析技术 A:16SrDNA序列 B:细菌分类与鉴定中的应用实例 A:16SrDNA序列 核糖体16SrDNA基因序列全长约1550bp，是由交替的保守区和可变区组成，利用保守区域能设计引物，此引物几乎能与所有种属的核糖靶位点结合。16SrDNA分子内的变异程度也许并不能区分亲缘关系十分接近的细菌，但DNA的多样性区域可提供序列的多态性信息，基因序列足够长，完全能够提供足够的信息鉴定病原微生物。通常靶序列在300-900bp之间就可以适用于多数广谱PCR的诊断。引物通常选择在具有互补的保守区域，如序列开始端、中间端(540bp)、序列末端(约1550bp)，在各