酶生产和分离的纯化.ppt

基本概念 2 酶分子修饰： 通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程。如金属离子交换法、 大分子修饰法 例如，Bender和Kosland成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的丝氨酸转换为半胱氨酸，修饰后，该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。 重要 6.2 酶的结构与功能 酶分子的修饰方法 化学法又可分为：金属离子置换法、大分子修饰法、肽链有限水解法、蛋白侧链基团的小分子修饰法等。 生物法是通过基因工程的手段改变蛋白质，即基于核酸水平对蛋白质进行改造，利用基因操作技术对DNA或mRNA进行改造和修饰以期获得化学结构更为合理的蛋白质。 物理修饰法的特点是不改变酶的组成和基团，酶分子的共价键不发生变化。 重要 酶原： 酶是在活细胞中合成的，但不是所有新合成的酶都具有催化活力，这种新合成酶的前体 (无催化活力) 称为酶原 (Proenzyme) 。 就生命现象而言，酶原是酶结构一种潜在的存在形式，如果没有这种形式，生命就会停止。 重要 酶 原 分子构象发生改变 形成或暴露出酶的活性中心 一个或几个特定的肽键断裂，水解掉一个或几个短肽 在特定条件下 酶原激活的机理 例如，哺乳动物的胰脏分泌到消化系绕中的胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原，每种酶原都是由二硫键交联的单一多肽链组成，它们在到达十二指肠以前，一直是十分稳定的，而到达十二指肠后则被另一种蛋白质水解酶所活化，这种活化过程是从无活力酶原转变成有活力酶的过程。该种酶原往往由该种酶所激活，称为酶原的自我激活。 胰蛋白酶原的激活过程 酶的多形性与同工酶 1975年H. Harris提出酶的多形性概念，认为很多酶可催化相同的反应，但其结构和物理化学性质有所不同，这种现象称为酶的多形性。根据其来源可分为异源同工酶和同工酶 (Isoenzyme) ，前者是不同来源的同工酶. 重要 例如，酵母菌中醇脱氢酶和动物肝脏中的醇脱氢酶，而后者是指来自同一生物体同一生活细胞的酶，能催化同一反应，但由于结构基因不同，因而酶的一级结构、物理化学性质以及其它性质有所差别，称为同工酶。测定同工酶最常用的方法是电泳法，此法对样品纯度要求不严格，分辨力强，而且简便快速。 例如天冬氨酸激酶 (AK) 有三种同工酶：AK1、AK2、AK3，磷酸葡萄糖变位酶有50种以上的同工酶。乳酸脱氢酶有5种同工酶：LDH1、LDH2、LDH3、LDH4和LDH5。 临床意义 心肌梗死和肝病病人血清乳酸脱氢酶LDH同工酶谱的变化 1 酶活性 心肌梗死酶谱 正常酶谱 肝病酶谱 2 3 4 5 谢 谢 ！ 第二章 酶的生产与分离纯化 (2学时，共4学时) 主要内容 酶分离、纯化的评价 酶的剂型与保存 酶的分子结构与催化功能 4 酶分离、纯化的评价 酶经分离、纯化后要确定该纯化步骤是否适宜，必须经过对有关参数的测定及计算才能确定。酶的产量是以活力单位表示，因此在整个分离过程中每一步始终贯穿比活力和总活力的检测、比较。 基本概念1 酶活力(Enzyme activity)：酶活力是指酶催化反应的能力，它表示样品中酶的含量。 1961年国际酶学会规定：l min催化lμmol分子底物转化的酶量为该酶的一个活力单位 ( 国际单位 ) ，温度为25 ℃，其它条件 (pH、离子强度) 采用最适条件。 重要 酶的总活力为样品的全部酶活力。 总活力 = 酶活力 × 总体积 (mL) 或 = 酶活力 × 总质量 (g) 比活力 (Specific activity) ：比活力是指单位蛋白质 (毫克蛋白质或毫克蛋白氮) 所含有的酶活力 (单位/毫克蛋白) 。 比活力是酶纯度指标，比活力愈高表示酶愈纯，即表示单位蛋白质中酶催化反应的能力愈大。 但是，比活力仍然是个相对酶纯度指标。要了解酶的实际纯度，尚需采用电泳等测定方法。 回收率 (Yield percent) ：回收率是指提纯前与提纯后酶的总活力之比。它表示提纯过程中酶的损失程度，回收率愈高，其损失愈少。 提纯倍数：提纯倍数是指提纯前后两者比活力之比。它表示提纯过程中酶纯度提高的程度，提纯倍数愈大，提纯效果愈佳。 酶纯化评价实例 5 酶的剂型与保存 酶制剂通常有下列四种剂型： 液体酶制剂 固体粗酶制剂 纯酶制剂 固定化酶制剂（见书中第五章） 5.1 液体酶制剂 包括稀酶液和浓缩酶液。一般除去固体杂质后，不再纯化而直接制成，或加以浓缩而成，一般需要加稳定剂。这种酶制剂不稳定，且成分复杂，只用于某些工业生产。 5.2 固体粗酶制剂 发酵液经杀菌后直接浓缩或喷雾干燥制成。有的加入淀粉等填充料，用于工业生产。有的经初步纯化后制成，如用于洗涤剂、药