可溶性蛋白含量测定法(考马斯亮蓝染色法).docVIP

可溶性蛋白含量测定（考马斯亮蓝染色法） 1. 试剂配制 （1） 考马斯亮蓝溶液配制：称取100 mg考马斯亮蓝，溶于50ml 90%乙醇中，加入100ml 85%（W/V）磷酸，再用蒸馏水定容到1L。在过夜后过滤并贮于棕色瓶中，常温下可保存一个月。 90% 乙醇配制：95%乙醇和75%乙醇按3:1体积比混合配制，即95%乙醇37.5ml，75%乙醇12.5ml或取45ml无水乙醇直接定容至50ml。 （2） 100 ?g/ml 牛血清蛋白（BSA）标准溶液：称取10mg BSA定容至100 ml即为100 ?g/ml。或称取25 mg BSA加蒸馏水水溶解后定容至100 ml，再从中吸取40 ml蒸馏水定容至100ml。 （3）0.05 mol/L，pH7.8磷酸配制： A母液，0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液：取Na2HPO4?12H2O (分子量358.14)35.85 g，用蒸馏水定容至500 ml。 B母液，0.2 mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4?2H2O (分子量156.01)1.5601 g，用蒸馏水定容到50 ml。 0.05M pH7.8磷酸：分别取A母液228.75ml，B母液21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。 2. 标准曲线绘制 取6支具塞试管，按下表加入试剂，摇匀，向各管中加入5ml考马斯亮蓝试剂，5min左右，以0号试管为空白对照，在595nm下比色测定吸光度，以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。 试剂 0号 1号 2号 3号 4号 5号 标准蛋白体积/ml 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 蒸馏水体积/ml 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00 蛋白质含量/?g 0 20 40 60 80 100 3. 样品测定 （1） 样品提取：取鲜样0.2—0.5g，用蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后，3000r/min—4000r/min离心10min，上清液备用。 （2） 吸取样品提取液1.0ml（视蛋白质含量适当稀释），放入试管中（每个样品重复两次），加入5ml考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置2min带反应完成，在595nm下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查蛋白质含量。 4. 蛋白质含量计算 可溶性蛋白含量（mg/g）=(C?VT)/1000VS（mg/g） C—查标准曲线值，?g； VT—提取液总体积，ml； WF—样品鲜重，g； VS—测定时加样量，ml