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叶绿体基因工程 姓名：李茂华 学号 摘要：叶绿体是植物细胞和真核藻类执行光合作用的重要细胞器，在叶绿体中表达外源基因比在细胞核中表达具有一些独特优势。叶绿体基因工程步骤类似核基因工程，叶绿体基因工程在提高植物光合效率、改良植物特性及生产生物药物等方面已得到应用。尽管叶绿体基因工程还存在同质化难度高、标记基因转化效率较低、宿主种类偏少等问题，但作为外源基因在高等植物中表达的良好平台其仍然具有广阔的发展和应用前景。 关键词：叶绿体 基因工程 应用 存在问题 叶绿体作为植物中与光合作用直接相连的重要细胞器，其基因组的功能也因此扮演着十分重要的角色。1882 年Straburger 观察到藻类叶绿体能分裂并进入子代细胞；1909年Baur 和Correns 通过在3 种枝条颜色不同的紫茉莉间杂交得出，质体是母本遗传的。人们便开始对叶绿体遗传方面产生了浓厚的兴趣【1】。1988 年Boynton 等首次用野生型叶绿体DNA 转化了单细胞生物衣藻突变体（atPB 基因突变体），使其完全恢复光合作用能力，标志着叶绿体基因工程的诞生【2】。叶绿体基因工程作为一种很具有发展前景的植物转基因技术，在植物光合作用、抗虫性、抗病性、抗旱性、遗传育种等方面都将有着越来越重要的意义。 1 叶绿体基因工程概述 1.1叶绿体简介 叶绿体是绿色植物光合作用的场所, 来源于古代的衣藻类原核生物, 含有双链环状DNA ( Manning , 1971 )叶绿体DNA 有IRA 和IRB 两个反向重复序列( 分别位于A 链和B链) , 两者基因大小完全相同, 只是方向相反, 它们之间有一个大的单拷贝区(large single copy region , LSC ) , 大小约80kb, 和一个小的单拷贝区( small single copy region , SSC )大小约20kb。多数叶绿体D N A大小在120一160kb, 最大2000 kb ( 伞藻) , 最小85 kb ( 刺海松)。叶绿体基因组中的基因在漫长的进化历程中, 有许多转移到了核中, 遗留在叶绿体中的基因是功能必需的一些基因, 有巨大的拷贝数( 一个叶绿体中, 基因拷贝数可达上百个; 一个细胞中, 基因的拷贝数可达上万个) , 而且它们都是原核生物来源的, 具有原核生物基因的特点叶绿体基因多为多顺反子转录单位, 这些转录单位中基因的排列顺序是高度保守的【3】。 1.2叶绿体基因工程优势 1.2.1 高效表达外源蛋白 外源基因在叶绿体基因组中稳定整合之后，能够使外源蛋白大量积累，这是因为在每一个植物细胞中质体遗传系统的多倍体特性可以使叶绿体基因组的基因拷贝数目多1000-10 000，保证了功能基因拷贝数维持在较高数量。此外，叶绿体转化体系消除了核转化体系中频繁出现的位置效应，因叶绿体转化载体两侧的同源序列保证了外源基因在和叶绿体基因组进行同源重组时的位点特异性，这就为外源基因的高效表达提供了有利条件。叶绿体转基因植物还具有其他一些优点，如不会出现转基因沉默现象。这使得转录本的积累比核转化植物可以高169 倍，并且外源蛋白的表达量在成熟叶片中可占可溶性蛋白的45.3%，在老叶片中占可溶性蛋白的46.1%【4】。 1.2.2 安全性好 在大多数被子植物中，叶绿体基因都是母系遗传的，所以这些叶绿体中的转基因不会通过花粉进行传播，使叶绿体转化成为创造和培养基因修饰的转基因植物的一个有价值的工具，并且产生更低的环境危害。因此，利用这种生物防范策略也可以使传统的和修饰的转基因作物共存，雄性不育遗传工程技术正是这种转基因防范策略的进一步体现【5】。此外，植物来源的医疗蛋白不受人类病原体和哺乳动物病毒载体的危害。因此，叶绿体系统为传统的生产系统，如微生物发酵或哺乳动物细胞培养等提供了一个可行的替代选择。 1.2.3 后代不易分离 母系遗传是叶绿体的遗传特性，因此在得到纯合并且稳定的叶绿体转化植株后，这样纯系的后代不会因有性杂交而分离，从而一直保持纯系【6】。除上述优点，叶绿体遗传工程还具有转基因累加的独特优势。例如，可以同时表达多个基因以实现通过一次转化就能生产多价疫苗。一些异源操纵子已经在转基因叶绿体中表达，多顺反子也没有先被加工成单顺反子就被成功翻译。此外，在叶绿体中合成的外源蛋白经适当的转录后修饰被正确折叠，包括生成二硫键、脂质修饰等【7】。 2 叶绿体转化步骤 2.1将外源DNA导入叶绿体外源DNA 穿过叶绿体的双层膜比穿过核膜要困难得多, 叶绿体转化的一个关键问题是DNA 进入细胞质后如何穿过叶绿体双层膜。目前最常用和最有效的方法是