分子病理学常用研究技术应用基本原理与应用.ppt

原位反转录PCR 将反转录反应和PCR结合，用于检测细胞内低拷贝mRNA 反应先以mRNA为模板进行逆转录反应合成cDNA 再以该cDNA为模板进行PCR 标本需经DNA酶预处理去除细胞内的DNA，以保证PCR所扩增的模板cDNA是mRNA的逆转录产物 原位再生序列复制反应(self-sustained sequence replication reaction) 以mRNA为模板，通过逆转录酶、DNA聚合酶和RNA酶的作用，以RNA/cDNA和双链cDNA为中间体，直接扩增RNA靶序列 扩增反应在42℃下进行两小时，不需要热循环 该法为检测细胞内低拷贝数mRNA提供了一个新方法 因扩增反应在较低温度下进行，组织抗原保存较好，便于和IHC相结合 原位PCR的不足 ①特异性不高，特别是假阳性不可避免 ②技术操作复杂，影响因素多 ③需要特殊设备，原位PCR仪是必不可少的设备 引物介导的原位标记技术 primed in situ labeling，PRINS 基本原理是PCR和原位杂交的结合 先由寡聚核苷酸引物或变性DNA片段与固定在细胞内的靶DNA互补序列复性结合，在聚合酶驱动下，反应体系中带有标记的dNTP即以靶DNA为模板延伸，新合成的DNA上即带上标记物 ISH（含FISH） 原位PCR PRINS 基本原理 标记探针与待检核酸互补结合成杂交体，通过检测探针获得靶核酸信号 PCR和ISH结合，先PCR，再与扩增后DNA原位杂交 PCR和ISH结合，特异引物与靶DNA互补结合，标记dNTP以靶DNA为模板延伸合成带标记信号的DNA 主要分类 直接法 间接法 直接法、间接法、原位反转录、原位再生序列复制反应 探针或引物 探针 引物 引物 酶促反应 否 是 是 扩增靶基因 否 是 否 优点 较好地定位和分析待检靶核酸，不受样本中其他成分干扰 高度敏感性 特异性好；操作简单；单次延伸，耗时少。 缺点 操作复杂；敏感性较低；有时需荧光显微镜 假阳性不可避免；操作复杂，影响因素多；需原位PCR仪 敏感性较低 适用范围 广泛用于基因组图、转基因检测、基因表达定位、核酸排列和运输、复制和细胞分类、产前诊断、肿瘤、传染性疾病诊断等 广泛用于生物医学研究和临床检测，特别是对外源性DNA分子如病毒基因的细胞定位检测。 应用较少，但有望取代FISH 组织图像采集与分析 IHC主要染色方法及原理 5S： specificity sensitivity simplicity safely save 直接法 间接法 PAP法 APAAP法 ABC法 —— 直接法（direct method） 用荧光素或酶标记的特异性抗体，直接与待检组织中的抗原反应，又称一步法 操作简单，特异性高而敏感性低 抗体需单独标记，生产成本高 最常用于肾活检组织及结缔组织病皮肤活检标本的IgG、IgA、IgM及补体等免疫相关蛋白的检测 也用于FCM测定各种细胞表面抗原 组织抗原 第一抗体 过氧化物酶 间接法（indirect method） 又称夹心法（sandwich method），分两步检测抗原或抗体。检测抗原时，先以未标记的特异性抗体（第一抗体）与组织或细胞中的抗原反应，洗去未结合的抗体后，再以酶或荧光素标记的第二抗体（抗抗体）与第一抗体结合，再显色或荧光检查。 敏感性是直接法的3-5倍，但特异性有所降低 最大优点在于不必标记每种第一抗体，只需要标记数量有限的第二抗体，利于商品化生产 非标记抗体法 抗体与酶或荧光素结合不可避免地会降低抗体与抗原结合能力，并影响标记物本身活性 酶桥法（enzyme bridge technique） PAP法（peroxidase antiperoxidase method） APAAP法 亲和素-生物素法 亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术（avidin biotin- peroxidase complex technique，ABC） ABC复合物由亲和素与酶标生物素以一定比例结合而成，亲和素作为桥梁，将ABC复合物与生物素化的抗体结合起来，再由抗体检出抗原 最大优点是敏感性高，背景干净，是目前应用最为广泛的免疫组化方法 亲和素-生物素法 酶标亲和素－生物素技术（labeled avidin-biotin technique，BA或LAB技术） 用亲和素分子直接与酶分子结合，形成酶－亲和素复合物，再与生物素标记的二抗结合，其敏感性较ABC法又有数倍提高。如用链霉亲和素（streptavidin, SA）代替亲和素，又衍生出LsAB法，该法避免了与切片中内源性生物素结合，特异性更高。 EnVision法 利用线状葡聚糖分子与大量酶结合，再将葡聚糖－酶复合物(EnVision复合物)