血清总胆红素及结合胆红素测定.ppt

血清总胆红素及结合胆红素测定;Ⅰ 重氮反应法测定总胆红素和结合胆红素;【实验原理】  血清中结合胆红素可直接与重氮试剂反应，产生偶氮胆红素；非结合胆红素须有加速剂咖啡因-苯甲酸钠-醋酸钠作用，其分子内氢键破坏后才能与重氮试剂反应，也产生偶氮胆红素。本法重氮反应pH6.5，最后加入碱性酒石酸钠使紫色偶氮胆红素(吸收峰530nm)转变成蓝色偶氮胆红素，在600nm波长比色，使检测灵敏度提高。;【检验原理】 总胆红素在pH3.0附近，在钒酸盐和表面活性剂存在下，可???被氧化成胆绿素。与此同时，胆红素特有的黄色也随之消失。测定胆红素氧化前后吸光度的差，可以计算出样品中总胆红素的浓度。;【试剂】 1．咖啡因-苯甲酸钠试剂 2．碱性酒石酸钠溶液 3．72.5mmol/L亚硝酸钠溶液 4．28.9mmol/L对氨基苯磺酸溶液 5．重氮试剂 6．5.0g/L叠氮钠溶液。 7．胆红素标准液 ;【操作步骤】 1.样品的测定 取3支试管，按下表程序操作. ;2.标准曲线制作 取5支试管，分别编号，然后按表稀释胆红素储存液配制胆红素标准液。; 混匀(不可产生气泡)，按总胆红素测定法操作。每一浓度作3个平行管，并分别做标准对照管，用各自的标准对照管调零，读取标准管的吸光度。配制标准液用的溶剂血清中尚有少量胆红素，同样测定后得一吸光度值。每个标准管的吸光度值均应减去此吸光度，然后与相应胆红素浓度绘制标准曲线 ;【参考范围】 血清总胆红素：5.1～19μmol/L(0.3～1.1mg/dl)； 血清结合胆红素：1.7～6.8μmol/L(0.1～0.4mg/dl)。 【临床意义】 1．血清总胆红素测定的意义 (1) 有无黄疸及黄疸程度的鉴别。 (2) 肝细胞损害程度和预后的判断 胆红素浓度明显升高反映有严重的肝细胞损害。但某些疾病如胆汁淤积型肝炎时，尽管肝细胞受累较轻，血清胆红素却可升高。 (3) 新生儿溶血症 血清胆红素有助于了解疾病严重程度。 (4) 再生障碍性贫血及数种继发性贫血(主要见于癌或慢性肾炎引起)，血清总胆红素减少。 ;2．血清结合胆红素测定的意义 结合胆红素与总胆红素的比值可用于鉴别黄疸类型。 (1) 比值＜20% 溶血性黄疸，阵发性血红蛋白尿，恶性贫血，红细胞增多症等。 (2) 比值40%～60% 肝细胞性黄疸。 (3) 比值＞60% 阻塞性黄疸。 但以上几类黄疸，尤其是(2)、(3)类之间有重叠。;谁是动名词？; ;【试剂】 1．0.1mol/LTris-HCl缓冲液(pH8.2) 称取三羟甲基氨基甲烷(Tris)1.211g，胆酸钠172.3mg,十二烷基硫酸钠(SDS)432.6mg，溶于去离子水90ml中，在室温(25～30℃)用1mol/L盐酸调节pH至8.2(约用6ml)，再加蒸馏水至100ml，置冰箱保存，此液含4mmol/L胆酸钠、15mmol/L SDS。 2．0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH4.5)。 3．BOD溶液 如系冻干品，按说明书要求复溶，但复溶后冰箱保存不宜过长(约可保存1周)，如系液体(可能含有甘油)，置4℃冰箱可保存较长时间，BOD贮存溶液的酶活性一般在数千至1万～2万U/L，BOD工作液酶活性可按反应液中BOD终浓度达0.3～1.0U/ml计算。 4．总胆红素标准液(342μmol/L) 按胆红素测定J-G法中方法配制，或市售合乎要求的标准液。 5．结合胆红素标准液 将DTB配于胆红素浓度可忽略不计的人血清中，或用冻干品按说明书要求重建。配制后分装于聚丙烯管内，－70℃保存，可稳定6个月。冻干品未重建前置低温中，至少稳定1年。 ;【操作步骤】 总胆红素和结合胆红素测定分别按表标准管进行。取4支试管，标明标准空白管，测定空白管，标准管和测定管。 ;加入BOD工作液后立即混匀，置37C水浴5min，用分光光度计，在450nm波长，去离子水调零，读取各管吸光度(A)。用于对照管的比色杯与非对照管的比色杯不得混用。;谢谢