淋巴细胞分离.docVIP

淋巴细胞分离与计数 淋巴细胞分离 原理： 外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。 实验材料： 淋巴细胞分离液 肝素 稀释液（生理盐水） RPMI1640粉末 实验设备：1ml移液器、移液管、 5ml注射器、刻度吸管、EP管、离心机、显微镜 操作流程： 在离心管中加入适量淋巴细胞分离液。 无菌采集静脉血若干毫升,注入盛有肝素的无菌小瓶中，（每1ml全血加0.1ml 125-250U/ml肝素溶液),加盖后立即轻轻摇匀,使血液抗凝 稀释（外周血：稀释液=1：2 取肝素抗凝血与等量生理盐水充分混 匀） 用刻度吸管沿倾斜的管壁，把稀释血缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面 （Ficoll：稀释血=1：2） 放入离心机1500r/min 离心20min（注:缓慢加速1-4档个3分钟 ） 用吸管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一离心管中，加入5倍以上体积的稀释液（生理盐水），1500rpm×10分钟离心，洗涤细胞。 重复洗涤一次，1500rpm×10分钟离心。 末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞 计数细胞后再调整细胞置所需浓度. 取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。 单个核细胞浓度(细胞数／1毫升细胞悬液)＝ 4个大方格内细胞总数　 　 ──────────　×　10４×2(稀释倍数) 4 分离出的淋巴细胞置于培养瓶中二氧化碳培养箱培养。 注意事项: 每毫升外周血液大约可获1×106单个核细胞 Ficoll应适量，外周血应充分稀释 温度直接影响到Ficoll的比重和分离效果 在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢加，以免冲散界面 吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污染 淋巴细胞计数： 实验流程： 准备计数板： 制备细胞悬液：收集细胞，制成单个细胞悬液 加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液， 计数：在显微镜下，用10×物镜观察计数板四角大方格中的细胞数 计算：将结果代入下式，得出细胞密度 胞数/毫升原 =（4大格细胞数之和/4）×104 注意事项： 取样计数前，应充分混匀细胞悬液 加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡 细胞压中线时，数上不数下，数左不数右 本法要求细胞密度不低于104细胞/ml 镜下计数时，细胞数过少或过多，说明稀释不当，需重新制备细胞悬液、计数