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第二章 基因工程的载体和工具酶 第一节 载体 引 言 基因克隆的本质是使目的基因在特定的条件下得到扩增和表达， 而目的基因本身无法进行复 制和表达、不易进入受体细胞、不能稳定维持，所以就必须借助于 “载体 ”及其 “寄主细胞 ” 来实现。 作为基因克隆的载体必须具备以下特性： ⑴载体必须是复制子。 ⑵具有合适的筛选标记，便于重组子的筛选。 ⑶具备多克隆位点（ MCS ），便于外源基因插入。 ⑷自身分子量较小，拷贝数高。 ⑸在宿主细胞内稳定性高。 一、质粒载体 （一）质粒的生物学特性 （1）质粒是独立于染色体以外的能自主复制的裸露的双链环状 (少数为线形和 RNA ） DNA 分子。 广泛从在于细菌细胞中， 比病毒更简单。 在霉菌、 蓝藻、 酵母和一些动植物细胞中也发现了 质粒， 目前对细菌的质粒研究得比较深入， 特别是大肠杆菌的质粒。 大肠杆菌的质粒主要有 F 质粒 （F 因子）、R 质粒 （抗药性因子） 和 Col 质粒 （大肠杆菌素因子） 三种。 （2 ）质粒的大小差异很大，最小的只有 1kb, 只能编码中等大小的 2-3 种蛋白质分子，最大 的达到 200kb 。 （3 ）质粒的生存在寄主细胞中 “友好 ”地 “借居 ”，离开了寄主它本身无法复制；同时质粒往 往有宿主专一性，如大肠杆菌的复制起点不一定能在其它生物细胞中繁殖。 （4 ）质粒的复制类型一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为该质粒的拷贝数。据拷贝数将 质粒分为两种复制型： “严紧型 ”质粒 （stigent plasmid ）,拷贝数为 1-3 ； “松弛型 ”质粒 （relaxed plasmid ）,拷贝数为 10-60。不过即使是同一质粒， 其拷贝数在不同的寄主细胞间和不同的生 长环境也可能有很大的变化。 （5 ）质粒的不亲和性 两种亲缘关系密切的不同质粒不能在同一宿主细胞中稳定共存。 载体 质粒与受体的质粒应是不同的不亲和群。 ⑹ 质粒的转移 转移性质粒，含有 tra 基因；能通过结合作用从一个细胞转移到另一个细胞。 非转移性质粒，不含 tra 基因；可以为转移性质粒所带动转移。 （7 ）质粒的存在形式有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种， （二）质粒 DNA 的制备 有多种分离质粒的方法，如碱裂解法、煮沸裂解法、层析柱过滤法等。 目前一般使用碱变性法制备质粒 DNA 。这个方法主要包括培养收集细菌菌体，裂解 细胞，将质粒 DNA 与染色体 DNA 分开及除去蛋白质和 RNA 。 1.碱变性法质粒提取的原理： 根据共价闭合环状质粒 DNA 与线性染色体 DNA 片断之间，在拓扑学上的差异而发展 出来的。 在 pH 值 12.0～ 12.5 范围内时，线性的 DNA 会被变性而共价闭合环状质粒 DNA 却不 会被变性。 通过冷却或恢复中性 pH 值使之复性，线性染色体形成网状结构，而 cccDNA 可以准确 迅速复性， 通过离心去除线性染色体，获得含有 cccDNA 的上清液，最后用乙醇沉淀，获得 质粒 DNA 。 2.碱变性法提取质粒的步骤： （1）取 1.5 毫升含质粒的大肠杆菌过夜培养物，加在微量离心管中，离心收集细胞沉淀； （2 ）加入 100 微升冰冷的溶液 I，（50mM 葡萄糖， 25mM Tris-HCl PH=8.0, 10mM EDTA ） 涡旋震荡悬浮菌液。 （3 ）加入 200 微升新配制的溶液 II ，（0.2M NaOH ， 1.0%SDS）缓缓混匀置室温 5 分钟。 （4 ）加入 150 毫升冰冷的溶液 III ，（醋酸