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实验九 动物骨髓细胞染色体的制备;了解制备中期染色体标本的原理
掌握动物骨髓细胞染色体标本的制备技术
观察染色体的数目以及形态特征; 在正常动物细胞中,骨髓是处于不断分裂的组织之一,骨髓细胞中的造血干细胞是生成各种血细胞和原始细胞,具有高度的分裂活性并且数量非常多。处于分裂期的细胞经秋水仙素或秋水酰胺处理后,由于阻断了纺锤丝微管的组装,使分裂细胞阻断在有丝分裂中期,此时染色体达到最大收缩,具有典型的形态,再经离心、低渗处理及固定、滴片、染色等步骤???便可制作较好的骨髓细胞的染色体标本。
;三、实验用品;1、秋水仙素处理:实验前一天晚上,按照青蛙每克体重4 ug的剂量,腹腔注射秋水仙素。
2、取股骨:将牛蛙处死,迅速取出股骨(为了获得较多的骨髓细胞胫骨亦可使用),用剪刀和纱布剥去全部肌肉组织,用骨剪剪开长骨两端的膨大部半透明软骨(不能全部剪断),程度以刚刚露出红色的骨髓组织为宜。收集前后肢提取6根骨头(每组3根)。;每组同学取前肢、后肢各一,获取长骨3根;3、取骨髓:用2 mL注射器吸取生理盐水2 mL,将针头插入骨髓腔,将红骨髓细胞冲入35 mm培养皿内,反复几次,直至骨头变白(需将随骨髓冲出物中大块白色脂肪组织用镊子挑出),将一只牛蛙的所有骨髓细胞集中在一只离心管中,吸打骨髓细胞,使细胞团块分散。;4、将骨髓细胞悬液转入2只1.5 mL离心管中(等体积,保证离心平衡),以1500 rpm离心10 min,弃去上清液.
5、低渗:每管加入0.5 mL KCL溶液,吸打混合均匀,将两管合并成一管,37℃水浴低渗25 min。(细胞膨胀,使滴片时细胞膜破碎,染色体分散)
6、固定:将低渗处理后的细胞悬液2000 rpm离心6 min,小心吸去上清液(弃去),每管加入新鲜配置的甲醇:冰醋酸(3:1)1 mL,用移液器将细胞轻轻吸打均匀,固定15 min。(固定细胞形态,阻止染色体收缩,使染色体结构免于破坏)
7、重复上面步骤一次。
8、 2000 rpm离心6 min,小心吸去上清液(每管约900 μL),留少量残液用吹打法将沉淀制备成细胞悬液。
9、滴片:在预先冷冻,用酒精浸泡的载玻片上,滴加1-3滴上层细胞悬液,在烘箱中烘干。
10、染色:将玻片平放于支架上,细胞面向上,每片滴加Giemsa染液数滴,染色10~20 min。
11、镜检:在自来水管下冲洗数秒,去掉染液,在烘箱中烘干,滴加甘油后盖上盖玻片,显微镜观察。;;首先在10倍镜下观察标本,应背景清晰,杂质较少,细胞分散良好。10倍镜下找到松散的细胞团,类似于线团,其染色比较致密的细胞核颜色浅。
转到40倍镜下,应能看到成X型的中期染色体,如分散较好的图像可以看清结构并数清其条数。在40倍镜下找到清晰图像后,可直接拍照保存,并记录下该图像大致位置(载物台上标本移动轴上对应位置)。
在40倍镜下将图像移至视野正中央,再下降载物台,滴香柏油转油镜观察图像,拍照保存。
观察完毕立即清理油镜镜头! 注意滴了油的载玻片不能在40倍镜下观察!
;五、实验结果;牛蛙骨髓细胞染色体核型(2n=26);
1、低渗与离心等步骤的操作要轻。
2、低渗处理极为重要,其目的是使细胞体积胀大,染色体松散。低渗不够,则染色体聚在一起,分散不好。太过,则造成细胞破碎,染色体丢失。
3、固定液要现配现用,固定彻底后再打散细胞团块,否则细胞容易破碎,染色体分散亦收到影响。
4、载玻片要预冷,冷却不够,则会影响染色体的附着和铺展。;七、作业
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