第3章 细胞生物学研究方法2008.ppt

利用各种显微镜进行观察的技术 肉眼的分辨率：0.2mm 光镜的分辨率：0.2μm 电镜的分辨率：0.2nm 一、光学显微镜技术 此技术在细胞学研究中起了重要作用，至今仍离不开 第一台有科研价值的显微镜是英国学者虎克（Robert Hooke) (一)普通复式光学显微镜技术 组成 （三）荧光显微镜技术 1、原理：某些荧光物质受紫外线照射发出荧光（可视光线），可根据荧光的有无观察物质在细胞内的分布。 2、应用：特异蛋白质等生物大分子的定位、定性。 3、荧光物质：受紫外线照射后能产生荧光的物质。 4、荧光物质的种类 荧光物质的种类 电子显微镜与光学显微镜的基本区别 电子显微镜的分辨本领与有效放大倍数 有效放大倍数:电子显微镜处于其分辨率(0.2nm)时的放大倍数。 “空放大” 分辨本领：电镜处于最佳状态下的分辨率 电子显微镜的基本构造 2、 电镜制样技术 样品要求： （1）样品很薄； （2）保持样品的精细结构 （3）样本必须十分干燥 （4）不能用载玻片和盖片，要用透明塑胶膜以及铜网或镍网来支持 徕卡切片机 冰冻蚀刻（freeze-etching）亦称冰冻断裂（freeze-fracture）。标本置于-100℃的干冰或-196℃ 的液氮中，进行冰冻。然后用冷刀骤然将标本断开，升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露出断面结构，称为蚀刻（etching）。 蚀刻后，向断面以45 度角喷涂一层 蒸汽铂，再以90 度角喷涂一层碳， 加强反差和强度。然后用次氯酸钠 溶液消化样品，把碳和铂的膜剥下 来，此膜即为复膜（replica）。复 膜显示出了标本蚀刻面的形态，在 电镜下得到的影像即代表标本中细 胞断裂面处的结构。 3) 冰冻蚀刻（freeze-etching） 人类红细胞 利用扫描隧道显微镜直接观察生物大分子，如DNA、RNA 和蛋白质等分子的原子布阵，和某些生物结构，如生物膜、细胞壁等的原子排列。 图2-20 尼康NT-88NE 显微操作/注射仪（图片来自） 第二节 生物化学与分子生物学技术 一、细胞化学技术 （二）显示方法 1. 金属沉淀法：利用金属化合物在反应过程中生成有色沉淀，借以辨认所检查的物质或酶活性。如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成CoS 或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。 2. Schiff 反应：细胞中的醛基可使Schiff 试剂中的无色品红变为红色。这种反应通常用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen 反应）。 3. 联苯胺反应：过氧化氢酶分解H202。产生新生氧，后者再将无色的联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。 （二）显示方法 4. PAS反应可确定多糖的存在。 5. “Nadi”反应：显示细胞色素氧化酶。 6. 脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。 7. 茚三酮反应：显示蛋白质。 8. 四氧化锇与不饱和脂肪酸反应呈黑色，用以证明脂肪滴的存在. Cell biology 细胞核 核仁 福尔根（Feulgen）反应模式图 样本经希盐酸水解后，DNA分子中的嘌呤碱基被解离，出现醛基。Schiff试剂中的无色品红与醛基反应，形成的化合物分子中有醌基，呈现紫红色。 免疫胶体金技术 用胶体金颗粒进行标记，在电镜下观察 在何处？ 荧光标记 的抗体 原来在这！ 将免疫学方法（抗原、抗体特异结合）与荧光标记技术相结合，用来研究特异蛋白质抗原在细胞内的分布、某种蛋白的分泌动态、胞内酶的研究、结构蛋白的定位。 三、显微光谱分析技术 细胞中有一些成分具有特定的吸收光谱，核酸、蛋白质、细胞色素、维生素等都有自己特征性的吸收曲线。例如，核酸的吸收波长为260nm，而蛋白质的则为280nm。 有的成分经组织化学染色后，对可见光有特定的吸收光谱。根据细胞成分所具有的这种特性，可利用显微分光光度计对某些成分进行定位、定性，甚至定量测定。 放射自显影术（radioautography；autoradiography）用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。 其原理是将放射性同位素（如14C 和3H）标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，将标本制成切片或涂片，涂上卤化银乳胶，经一定时间的放射性曝光，组织中的放射性即可使乳胶感光。然后经过显影、定影处理显示还原的黑色银颗粒，即可得知标本中标记物的准确位置和数量，放射自显影的切片还可再用染料染色，这样便可在显微镜下对标记上放射性的化合物进行定位或相对定量测定。 这种技术与电镜样品处理结合，则为电镜放射自显影。 四、放射自显影 应用：细胞内生物大分子的合成动态 制片 涂乳胶 自显影（曝光）