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第五章 细胞融合 细胞工程多媒体教案 主讲人：王文星 东北大学理学院 主要内容 5.1 细胞融合的定义 5.2 细胞融合的意义 5.3 细胞融合的建立和发展 5.4 细胞融合的基本原理 5.5 融合材料的制备 5.6 细胞融合的方法 5.7 融合细胞的选择 5.8 细胞融合的应用与举例 5.9 小结 5.10 思考题 不同细胞融合方法比较 细胞融合的影响因素 植 物 细 胞 融 合 PEG诱导融合时的作用时间 PEG规格和纯度 电场融合时，融合率与原生质体密度 加入CaCl2 对原生质体进行预处理 动 物 细 胞 融 合 亲本细胞表面性质的影响 细胞种类 温度和运动状态 氧气条件 Ca2+条件 pH影响 思考题 1. 细胞融合有怎样的意义？ 2. 细胞融合的主要方法有哪些？特点分 别是怎样的？ 3. 怎样选择融合后的杂合细胞？ 4.简述利用杂交瘤技术进行单克隆抗体大规模生产的技术步骤与要点。 本 章 小 结 本章主要讲解了细胞工程的核心技术——细胞融合。通过这章的学习，应掌握细胞融合的定义，意义，主要方法及其重要应用——单克隆抗体制备原理及过程。了解细胞融合的发展过程及其应用等。 * 5.1 细胞融合的定义 细胞融合（Cell fusion)是指在自发或人工诱导下，两个或两个以上异源的细胞或原生质体相融合形成杂种细胞，并使之分化再生、形成新物种或新品种的技术。 5.2 细胞融合的意义 细胞融合不受种属的局限，可实现种间生物体细胞的融合，使远缘杂交成为可能，因而是改造细胞遗传物质的有力手段。它的意义在于从此打破了依赖有性杂交重组基因创造新种的界限和生殖壁垒，极大地扩大了遗传物质的重组范围。 随着细胞融合技术的不断改进，现在这项技术已经广泛应用于细胞学、遗传学、免疫学、病毒学等多种学科的研究工作中。 甘蓝型欧洲油菜 5.3 细胞融合的建立和发展 细胞融合的发现: 1838年，Muller是叙述脊椎动物多核细胞的第一人。 1875年，Lange首先观察到脊椎动物血液细胞融合。 1960年，Baski首先在两种不同类型细胞的混合培养物中获得自发的融合细胞。 动物方面： 1962年，日本冈田善雄首次用灭活的仙台病毒在体外人工条件下诱导艾氏腹水瘤细胞融合。 1965年，英国海利斯等进一步证实了灭活的病毒可以诱发动物细胞融合。 1970年，Ruddle等开始系统地用融合细胞作为实验系统来绘制人类基因图。 1970年，Ladda发展了用去核的小鼠成纤维细胞进行融合实验，开始了各种细胞重组的研究工作。 1975年，英国Milstein和Kohler 在细胞融合技术的基础上创立了单克隆抗体技术。 5.3 细胞融合的建立和发展 植物方面： 1937年，Michel用硝酸钠处理原生质体使之融合，但那时还未用酶法大量分离原生质体，因此，植物细胞融合的起步比动物细胞融合要迟10年左右。 1960年，Cocking 成功地用酶法制备了大量的原生质体，大大促进了植物原生质体的融合研究。 1972年，Carlson等首次将粉兰烟草和郎氏烟草两个异种的体细胞融合成功。 1974年，高国楠发现聚乙二醇能促进植物原生质体融合。 20世纪80年代发展了电诱导原生质体融合技术。 20世纪90年代又发展了激光融合仪。 5.3 细胞融合的建立和发展 纵观细胞融合技术的发展历史，该技术的不断改进首先表现在融合剂上，从致癌活病毒到灭活病毒再到化学物质，其次体现在新方法上，再者体现在融合对象的不断扩展上。现在新的细胞融合方法一般采用将化学法和物理法结合起来进行，如将磁、超声、机械等和激光、电相结合，同时添加化学剂以便进一步提高融合率，细胞融合的方法和手段始终朝操作方便、简单，便于量化研究，同时融合率又能得到不断提高的方向发展。 5.3 细胞融合的基本原理 细胞融合的原理示意图 （1） （1） （2） （6） （3） （4） （5） Cell A Cell B 显微镜下燕麦原生质体的融合过程 5.3 细胞融合的基本原理 A B C D E F 5.5 融合材料的制备 1. 植物或微生物原生质体的制备： 2.动物单细胞的制备： ？ （1）组织的获得 （2）组织的消化 （1）组织的获得 （2）组织的消化 1 2 3 4 5.6 细胞融合的方法 诱导细胞融合的方法 生物法 化学法 物理法 仙台病毒法（HVJ）等 聚乙二醇（PEG）结合高钙离子、 Ph诱导法等 显微操作、电融合法等 生 物 法 仙 台 病 毒 法 Cell A 在PEG和Ca2+存在下混合 再生 Cell B 原生质体化 化学 法 PEG 结合高Ca2+和 pH诱导