牛轮状病毒的分离鉴定和疫苗研究进展.docVIP

我国牛轮状病毒的分离鉴定和疫苗研究进展 摘要：本文对牛轮状病毒的分离鉴定和疫苗研制这两方面的研究进展做一综述。 关键词：牛轮状病毒；犊牛腹泻；分离鉴定；疫苗； 牛轮状病毒（Bovine Rotavirus，BRV）是引起牛传染性腹泻疾病的重要病原之一。自然条件下，不同品种、不同年龄的牛都均具感染性，但以犊牛主发。据报道，目前国内外发现的BRV均为A组或G5、G6、G8、和G10血清型。迄今国内已检测到的BRV均属于G6、G10血清型的，对BRV的研究多集中在毒株的检测和疫苗的研制方面，本文就此做以综述。 分离鉴定 1.1分离方法 自1969年Mebus等[1]在电镜下观察到BRV并成功分离毒株以来，各国有关BRV分离方法的研究报告不断出现。我国在这方面的研究报道始于1984年，吴城等[2] 从福建某县采集了25份患有BRV腹泻疾病的牛粪便，经处理接种于牛肾原代细胞，传代后细胞始终未出现典型病变。而次年刘纯荣等[3]应用MA-104细胞由耗牛病料分离出了4株轮状病毒。李昌仁等[4]1987年同样使用MA-104细胞成功的从黑龙江省腹泻犊牛粪便中分离出了4株BRV，命名为DNRV1、DNRV2、DNRV3、DNRV4。孙继国等[5]1996年对BRV NCDV株在MA-104、LLc-mk2和Hela三种细胞中的生长情况进行了比较研究，结果是在MA-104细胞上生长最好， HeLa细胞上不生长，在LLc-mk2细胞上虽然能生长，但无细胞病变。苏小康等[6]2005年应用Marc145细胞成功分离出了一株BRV。目前分离BRV所使用的细胞首选为MA-104细胞。它能够给BRV提供一个很好的增殖环境。 1.2鉴定方法 有关毒株的鉴定方法种类繁多，根据其各自的优缺点应用在不同的情况下。通常为了对分离株进行充分、系统的鉴定会同时采用一种以上的方法。现将常用、可靠的鉴定方法简介如下。 1.2.1 电镜法 在BRV的检测中常用的电镜方法有直接电镜和免疫电镜两种。直接电镜法操作简单、结果可靠，但检出率受病毒粒子数量、完整性的影响，因此往往结合其他方法一同使用。免疫电镜比直接电镜敏感性更高，更易观察，检出率是直接电镜的10倍以上，并可同时检出不同的血清型。我国李决等[7]人1987年应用电子显微镜技术、PAGE和ELISA等方法，首次在河南的腹泻犊牛粪便中检测出了轮状病毒。后来又有关平原等[8]应用直接电镜和免疫电镜方法对腹泻犊牛的粪便、肠内容物进行检测，结果在两种病料中均见BRV粒子。证实了电镜方法用作BRV腹泻诊断是可行的。近年栾婧婧等[9]从爆发犊牛腹泻的牛群中分离到一株BRV，应用电镜技术较为系统的观察了病毒在宿主细胞中的形态结构变化和宿主的结构变化,丰富了BRV的鉴定依据。因电子显微镜具有极高的放大倍数，可使病毒粒子的形态结构清晰可见的特点，使其至今仍广泛应用在BRV的检测中。但电镜检测所需成本较高，不适于大量样品的检测。 1.2.2聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） PAGE可将BRV RNA的11条带清晰的呈现在电泳图上，根据这11条带的分布进行A~G的分组，同时反映了病毒RNA基因组的差异和变异，现已检测到的BRV均为A组，其电泳条带呈4：2：3：2的特征分布。倪亚伟[10]1986年采用PAGE的方法对已分离出的四株BRV进行鉴定，结果电泳图谱呈现出BRV典型的11条带，进一步分析发现分离株BRV6576和BRV6555的第7、8、9三条带之间的距离具有明显差异。这为分子流行病学的调查提供了依据。付新成等[11]2009年从疑似轮状病毒腹泻犊牛粪便样品中提取病毒RNA， PAGE检测结果是6个样品中有4个样品的电泳条带呈现A组BRV特有的4∶2∶3∶2分布。由此证明该牛群存在A组BRV感染。PAGE作为BRV鉴定方法之一，具有特异性强，操作、设备简单等优点，但病毒的RNA易降解导致假阴性的结果出现。 1.2.3 早在1983年世界卫生组织已将ELISA列为诊断轮状病毒的标准方法。在我国有关这方面的报道最早见于1985年刘纯荣等[12]应用ELISA、ELISA阻断试验、免疫电镜、PAGE和细胞培养等方法对四川省耗牛进行检测。证实了BRV是四川耗牛腹泻的主要病原。类似的报道还有李决等 [7] 人和林雪等 [13] 人先后对河南地区犊牛粪便样品的检测时应用到了此方法。梅魁敏等人[14]应用该方法在江西省养牛业中检测到BRV的存在。2009年曹竹婷等[15]确定了间接ELISA检测牛血清中BRV抗体的最佳工作条件及判定标准，实验表明该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单快速等特点，适合于对BRV特异性抗体的动态监测和批量检测。ELISA不仅适用于临床标本的抗原、抗体的检测，也适合于进行大规模样品的检测，开展流行病学调查。除具有灵敏、特