酶生产与分离纯化瑶瑶.pptVIP

欲分离的混合溶液自柱顶加入 洗脱剂。 解吸、吸附、再解吸、再吸附 吸附层析 吸附剂与洗脱剂的选择 洗脱剂的选择 极性种类有：醇、酮、酚等。 洗脱剂的选择要注意下列各点： 洗脱剂不会与吸附剂起化学反应，不会使吸附剂溶解； 洗脱剂对混合液中的各组分的溶解度大，粘度小，流动性好 纯度 离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同 阳离子交换剂 阴离子交换剂 离子交换层析 凝胶过滤 分子筛层析 以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同 凝胶层析 凝胶过滤(gel filtration chromatography) 溶质分子的大小 操作方便，不会使物质变性，反复使用 凝胶层析剂的容量比较低 原理 葡聚糖凝胶 琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力 酶与底物 酶与竞争性抑制剂 抗原与抗体 酶RNA与互补的RNA分子或片段RNA与互补的DNA分子或片段 亲和层析 （6） 产酶促进剂 产酶促进剂 一是诱导物，二是表面活性剂。表面活性剂能增加细胞的通透性，改善氧的传递速度，保护酶的活性。 重要 发酵方式的选择 固态发酵法 液体深层发酵法 (1) pH对产酶的影响 一般来说，培养基成分中碳/氮(C/N)比高，发酵液，pH低；C/N低，pH高。 添加缓冲液；调节通风量.调节培养基的初始pH；pH过高糖或淀粉来调节，pH过低氮调节。 一般细菌为37 ℃，霉菌和放线菌为28～30 ℃，而生产糖化酶的最适温度为37～40 ℃。 (2) 温度对产酶的影响 微生物代谢反应、发酵中通风、搅拌速度 发酵初期 菌体繁殖旺盛时 (3)耗氧量和通风量对产酶的影响 溶解氧而定。目前用于酶制剂生产的微生物都为好气性微生物，采用自动测定和记录溶解氧的仪表。 (4) 搅拌的影响 有利于热交换、营养物质与菌体均匀接触，提高新陈代谢。打破空气气泡，使发酵液形成湍流，提高溶氧量，增加空气利用。 (5) 泡沫的影响 泡沫阻碍了CO2的排除，影响溶氧量 机械消泡，消泡剂 食品用酶发酵生产实例 1、α-淀粉酶的生产 生产菌种：细菌和曲霉，如枯草芽孢杆菌、黑曲霉等。 发酵方法：霉菌，固体曲法；细菌，液体深层发酵。 回收方法：盐析、有机溶剂沉淀和淀粉吸附等。 2、果胶酶的生产 生产菌种：真菌如曲霉菌、青霉菌，细菌如枯草芽孢杆菌、欧氏杆菌。 发酵：固体曲法和液体深层发酵 回收：水提后加入乙醇沉淀。 酶的分离纯化 酶的纯化 特定的一种酶在细胞中的含量很少 酶可以通过测定活力加以跟踪 酶分离纯化的一般原则 1、可靠和快速的测活方法； 2、酶原料的选择； 3、酶的提取； 4、酶的提纯； 5、酶的纯度检验。 酶提取分离纯化技术路线 发酵培养 动物器官 植物组织 微生物 提取 胞内酶 胞外酶 细胞破碎 研磨 酶分离纯化 离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。 酶浓缩 酶贮存 机械破碎 捣碎法 研磨法 匀浆法 物理破碎 温度差破碎法 压力差破碎法 超声波破碎法 化学破碎 有机溶剂： 甲苯、丙酮 丁醇、氯仿 表面活性剂： Triton、Tween 酶促破碎 自溶法 外加酶制剂法 通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。 使组织、细胞的外层结构破坏 对细胞膜的作用 通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏， 细胞破碎方法及其原理 (1) 机械 (匀浆) 法 (2) 超声波法 处理的主要问题是超声空穴局部过热引起酶活性丧失，时间应尽可能短，容器周围以冰浴冷却处理。 (3) 冻融法 生物组织冰冻后，胞液结成冰晶，使细胞壁胀破。 加入蛋白酶抑制剂，如PMSF(苯甲基磺酰氟)络合剂EDTA、还原剂DTT (二硫苏糖醇)。 (4) 渗透压法 (5) 酶消化法 (6) 化学破碎法 ① 有机溶剂处理 ② 表面活性剂处理 与细胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用使细胞膜结构破坏，增加膜的透过性。 酶的提取 盐溶液提取 酸溶液提取 碱溶液提取 有机溶剂提取 温度：一般在00C~100C。 pH：在酶的稳定范围内，远离等电点pH。 缓冲液：0.15mol/L氯化钠、 0.02~0.05mol/L磷酸 提取液体积：一般为原料体积的1-5倍。 保护剂：底物、辅酶、某些抗氧化剂、 表面活性剂等。 酶的主要提取方法 提取方法 使用的溶剂或溶液 提取对象 盐溶液提取 0