第三章 生物样品制备（三）.ppt

临床实验室传统生化检测工作流程 样品传输系统 开盖子 离心储存管理器 自动离心 盖盖子 样品分拣 自动分装 在线分析接口 罗氏分析接口 技术人员进行样本接收 技术人员在LIS系统中领取标本，核对并按顺序生成工作清单 技术人员清点标本、对样本进行编号，移取标本到处理管中 技术人员对标本按顺序进行处理 技术人员手动录入工作清单，并将编辑生成仪器运行列表 仪器按照列表对样本进行检测 技术人员对结果进行审核，生成结果列表；并对数据情况进行登记 技术人员将结果列表导入LIS系统，生成结果报告；审核批准 临床色谱质谱实验室检测工作流程 临床色谱质谱实验室检测工作流程-时间占比 临床色谱质谱实验室检测工作流程—出错来源 样品处理 30% 操作者 19% 色谱柱 11% 污染 4% 标准曲线 9% 仪器 8% 样品引入 6% 积分 6% 色谱图 7% 样品制备=样品处理+操作者+污染 大约占到50% 样品制备时间长，易出错，why？ 样品采集 分析检测 原形样品不适合直接进行在线分析！ 种类繁多——血液、尿液、唾液、乳汁、组织等； 成分复杂——数百乃至上千种化合物，大分子（蛋白质、核酸），小分子（脂肪、糖、尿酸）； 浓度太低——待测物含量低，不进行富集浓缩，仪器灵敏度无法满足直接检测要求； 样品太“脏”——基质组分的存在影响样品测定，产生基质效应； 太“危险”——污染物可能成为“色谱柱杀手”、离子源污染。 太“脏”？“太“危险”？ 样品制备目的 样品制备原则 四、 生物样品类型 临床检验生物样品的类型 临床色谱质谱实验室常用生物样品类型 血液样品 全血 混合5~10次 混合5~10次 2000-3000rpm 5-10min 放置30~60min 2000-3000rpm 5-10min 尿液样品 唾液样品 无剌激安静状态下进行； 采集前应漱口，除去口腔中的食物残渣； 唾液自然分泌； 采集后离心，分取上清液作为分析样品。 组织样品 肿瘤、病变组织等 干血滤纸片（dried blood spot，DBS） 方法：将全血采集在滤纸片上，干燥后得到干血斑块，经溶剂萃取后，通过荧光反应法、串联质谱法等分析干血斑中待检测组分的信息来反映患者的诊断结果 特殊生物样品类型 应用范围：新生儿筛查、代谢产物含量、酶活性代谢相关疾病的筛查、药物动力学研究、基因检测及病毒DNA含量等? 随着串联质谱技术等的发展，干血滤纸片在遗传代谢类疾病的诊断及筛查中的应用价值日渐突显 干血滤纸片 干血滤纸片 尿滤纸片 特殊生物样品类型 保存、运输方便，稳定性较好，降低成本 五、常用样品制备技术 临床实验室样品制备技术 液液萃取 稀释 固相萃取 离心 过滤 样品制备技术 蛋白沉淀 临床色谱质谱实验室常用样品制备技术 衍生化 为什么要蛋白沉淀？ 蛋白质的存在会形成泡沫、浑浊或出现沉淀而严重干扰分析测定； 若直接进样，蛋白质会沉积在色谱柱上，造成色谱柱的污染、堵塞，严重缩短色谱柱的寿命。 （一）蛋白沉淀法（protein precipitation,PPT） 定义 通过加入某种试剂，改变溶液环境，使蛋白质的构象发生变化，导致溶解度降低，生成不溶性颗粒。 NO!!! 基本步骤 （一）蛋白沉淀法 * 添加心脏图 * * * 明确生物样品制备的目的和要求 分析测定的目的是进行已有物质的分析还是发现新物质，是定性分析还是定量分析。 掌握生物样品基质的性质及特点 基质的存在不仅降低分离度，干扰目标分析物的测定，而且会增加本底的噪音，降低检测灵敏度。 考虑样品的量或体积 样品是否容易获得，或获得的生物样品的体积是否满足制备方法的要求。 尽可能防止和避免欲测定组分发生化学变化或损失 样品制备过程中某些样品组分可能会发生变化，如光学变化、水解等，导致待测物的浓度和组成发生改变 注意分析物的浓度及存在形式 分析物浓度高低对样品用量、检测灵敏度、提取回收率、是否衍生化等有影响。化合物存在形式如游离态、结合态、代谢物等，则要考虑是否需要水解、超滤、测定代谢物等因素。 是否有特殊的化学修饰或衍生化 该化学反应必须是已知且能定量完成，才能保证获得准确可靠的分析测定结果。 防止和避免欲测定组分被污染 分析过程一定要有效防止污染，尽可能减少无关化合物的引入 样品的制备方法尽可能简单易行 在决定采用何种技术制备样品时，还要考虑制备所需要的时间和费用，在能满足质谱分析需要的 * 全血的制备：将采集的血液置于含有抗凝剂的采血管中，但不经离心操作，保持血浆和血细胞混合在一起，则称为全血。 血浆的制备：将采集的静脉血置于含有抗凝剂的采血管中，混合后，以2000~3000rpm离心5~10min,使血浆与血细胞分离，所得淡黄色上清液即为血浆。 血清的制备：将采集