核酸的分离提取.ppt

主要内容 第一部分 核酸的分离制备 第二部分 PCR技术 第三部分 主要分子标记 第四部分 基因克隆 第一部分：核酸的分离制备 DNA 提取是一切分子生物学研究最基础的技术，高质量的DNA是用于PCR和酶切分析等系列后续操作的重要保证 发展了多种DNA 提取方法,可从植物叶片、愈伤组织、组培苗、果实、韧皮部等多种组织器官中提取DNA；但不同植物、同种植物材料的不同来源、部位、形态以及不同化学成分、组织结构特点差异,导致DNA 提取时需要选择不同的方法或作一些特殊处理 从富含多糖、多酚、单宁、色素及其他次生代谢物质的木本植物中提取DNA的方法难度就相对大于大多数禾谷类及蔬菜类植物 （1）多酚被氧化成棕褐色 （2）多糖、单宁等物质与DNA 会结合成粘稠的胶状物,获得的DNA 常出现产量低、质量差、易降解，影响了DNA 质量和纯度，不能被限制性内切酶酶切，严重的甚至不能作为模板进行PCR 扩增 （1）植物材料的采集及前处理 尽可能使组织材料保持水分而保鲜（用湿纱布包裹,放置于密闭的冰盒等） 野外远距离采集样本时，尽可能采用冷冻保存(如放置于液氮中) 不具备冷冻条件时 无水CaSO4 的瓶子分别保存使其迅速干燥，可将材料 保存数月，返回后尽快提取DNA 对具有大量次生代谢物(如丹宁、酚类、醌类等) 的植物材料,尽可能采集幼嫩组织，冷冻保存、短时间内提取DNA 植物组织化学保存法 乙醇、丙二醇处理法 导致DNA剧烈降解（不推荐） 样品长期保存 液氮处理后贮存在- 80℃冰箱或直接储放于液氮中 在与提取缓冲液接触前防止冰冻样品在空气中融化导致酚类易被氧化 实验室发苗、田间取叶片（清洗去除灰尘、泥土以及菌孢子等） 饥饿处理减少淀粉含量、遮光处理产生黄化苗 （6） DNA纯度和浓度检测 0.8%琼脂糖凝胶电泳或紫外分光光度计检测 琼脂糖凝胶电泳法(常用） DNA样品在紫外线照射下发出的红色荧光强度与DNA的含量成正比 使用标准浓度的DNA样品作对照，可以估计出被测DNA的浓度 紫外分光光度计检测 DNA在260nm处有一个明显的吸收峰估计浓度 在A260 1OD相当于双链DNA浓度50 μg/mL 根据A260/A280比值估计DNA纯度 纯DNA 的A260/A280=1.8±0.1， RNA的比值为2.0左右。 >1.8 可能有RNA未除去 <1.8 可能有酚和蛋白质之类的杂质 8. 常用植物总DNA提取方法及主要原理 8. 常用植物总DNA提取方法及主要原理 CTAB法及主要原理 CTAB----Hexadecyl trimethyl ammonium bromide; Cetrimonium bromide; CTABr; Palmityl trimethyl ammonium bromide/十六烷基三甲基溴化铵 分子式 C19H42NBr?分子量 364.10；白色或浅黄色结晶或粉末，低温时易沉淀 一种阳离子去污剂，在低离子强度时(0. 1-0. 5 mol/ L NaCl) ，沉淀核酸与酸性多聚糖, 而蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里， 在高离子强度时(> 0.7 mol/L NaCl) ，可与蛋白质和酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，不能沉淀核酸 因此，CTAB可从大量产生黏多糖的植物以及某些革兰氏阴性菌（包括大肠杆菌的某些株）制备纯化的DNA，这种去污剂加入调节至高离子强度的细菌和细胞裂解液中(> 0.7 mol/L NaCl)，经过连续的酚/氯仿有机溶剂抽提，去除CTAB/黏多糖/蛋白质复合体，异丙醇/无水乙醇沉淀上清即可将DNA分离出来 CTAB还有提高DNA互补链复性速率及稳定已形成的DNA双螺旋的作用 CTAB法的主要特点是应用范围较广 （1）2g 幼嫩植物组织加液氮并迅速研磨成细粉，置入50mL离心管中缴入预热治65℃的10mL的2×CTAB缓冲液，轻摇混匀 （2）65℃水浴2h，轻摇混匀 （3） 冷却至室温，加入等体积的氯仿-异戊醇（24：1），轻轻上下颠倒混匀直至上清