PCR污染的产生及防治（技术原理培训）.pptVIP

PCR的反应基本步骤 PCR的反应基本步骤 变性：高温使双链DNA解离成单链（94 ℃ ，30s） 退火：低温下，引物与DNA模板互补区结合（55 ℃ ， 30s ） 延伸：中温延伸，DNA聚合酶催化以引物为起点的DNA链延伸反应（70~72 ℃ ，30~60s） PCR的反应体系 10×扩增缓冲液 1/10体积 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 (2个) 0.2umol/L 模板DNA 102 ～ 105  Taq DNA聚合酶 1 ～ 2.5单位/反应体系  Mg2+ 1.5～2.5mmol/L 加双或三蒸水至 25 ～ 50ul PCR反应五要素 引物（primer） 酶 （Taq DNA polymerase） dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） 模板 （template） Mg2+ （magnesium） 引物 引物是PCR特异性反应的关键 PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度 理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用 PCR就可将模板DNA在体外大量扩增 引物设计的原则 引物最好在模板cDNA的保守区内设计 引物长度一般在15~30碱基之间 引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃ 引物3′端要避开密码子的第3位 引物3′端不能选择A，最好选择T 碱基要随机分布 引物自身及引物之间不应存在互补序列 引物设计的原则 引物5′ 端和中间△G值应该相对较高，而3′ 端△G值较低 引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰 扩增产物的单链不能形成二级结构 引物应具有特异性 酶及其浓度 目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应 天然酶：从栖热水生杆菌中提纯 基因工程酶：大肠菌合成 一个典型的 PCR反应约需酶量 2.5U（指总反应体积为100 ul时） 浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少 dNTP 的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和 PCR扩增效率有密切关系 dNTP呈颗粒状， 保存不当易变性失活 dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris-HCl的缓冲液将其pH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解 在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制 ）， 如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量 dNTP 能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低 模板（靶基因，target gene） 模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一 传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K 来消化处理标本 SDS 的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀 蛋白酶K 能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白, 再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸 Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响 在一般的 PCR反应中，各种NTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0 mmol/L为宜 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少 PCR反应条件的选择 PCR反应条件: 温度 时间 循环次数 温度与时间的设置 设置变性-退火-延伸三个温度点 标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸 对于较短靶基因（长度为100～300bp时）可采用二温度点法， 将退火与延伸温度合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸 变性温度与时间 变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因 一般93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性 若低于93℃则需延长时间 但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。 此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败 退火(复性)温度与时间 退火温度是影响PCR特异性的较重要因素 变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞