实验2-分离以尿素为氮源的微生物培训讲学.ppt

第一章 微生物的利用 实验2 分离以尿素为氮源的微生物 课题背景：尿素是一种重要的农业氮肥。但是尿素不能直接被农作物吸收。只有当土壤中的细菌将尿素分解成氨气以后，才能被植物利用。而土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶。 什么是尿素和脲酶？ （NH2）2C=O +H2O 脲酶 2NH3 + CO2 尿素：又称脲，是蛋白质降解的产物。 脲酶：降解尿素的酶。 如何筛选分解尿素的细菌？ 原理：培养基中的唯一氮源是尿素，只有能分解尿素的细菌（能合成脲酶）能够在该培养基上正常生长和繁殖。 碳源 氮源 实验原理 利用将尿素作为唯一氮源的选择培养基分离出能利用尿素的细菌，再通过稀释涂布分离法，将该菌分散开来，以形成单菌落。 细菌合成的脲酶能将尿素分解成NH3，致使 pH 升高，碱性增强，使酚红指示剂变红。 酸碱指示剂：酸黄碱红 例题：下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是（ ）A. KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4.7H2O、葡萄糖、尿素、琼脂、水 B. KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4.7H2O、葡萄糖、琼脂、水 C. KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4.7H2O、尿素、琼脂、水 D. KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水 选择培养基：只能以尿素为唯一氮源。 实验设备及用品 三角瓶、试管和试管架、培养皿、超净台、移液器、玻璃刮刀、酒精灯。 从土壤中采集微生物 土壤采样方法：用小铲子去除5 cm表土，取离地面5-15cm处的土样1克，盛于预先灭菌的牛皮纸袋中扎紧。 从有哺乳动物排泄物的地方取得 稀释涂布分离法 玻璃刮刀 Step1：培养基的配制和灭菌 全营养LB培养基/25mL 尿素培养基/25mL 蛋白胨 0.25g 酵母提取物 0.12g NaCl 0.25g 琼脂糖 0.5g 水 25 mL 葡萄糖 0.025g NaCl 0.12g K2HPO4 0.12g 酚红 0.25g 琼脂糖 0.5g 水 15mL 尿素溶液 10mL 特别注意：尿素溶液用G6玻璃漏斗过滤，使之无菌。 Step2：倒平板 ②将已灭菌的LB固体培养基和尿素固体培养基在酒精灯火焰旁分别倒入培养皿中，在超净台上摇匀，平放至凝固。 冷却至60℃ Step3：制备细菌悬液 1g 土样 99 mL 无菌水 10-2稀释液 10-3、10-4、10-5稀释液 怎样梯度稀释菌液？ 高浓度→低浓度，换枪头 微量移液器 平行重复 每一个稀释度的菌液：接种到3个培养皿中。 Step4：用涂布分离法分离细菌 全营养LB培养基 （对照组） 尿素培养基 （实验组） 10-3 10-4 10-5 需要倒3个LB平板，9个尿素平板 重复1 重复2 重复3 重复1 重复2 重复3 重复1 重复2 重复3 取10-3、10-4和10-5的土壤稀释液各0.1 mL，分别加到有LB培养基和尿素培养基的培养皿中。 在酒精灯火焰旁打开培养皿，用玻璃刮刀将菌液涂布到整个平板上。 70%酒精 恒温培养箱 Step5：恒温培养箱中37℃培养 培养皿要倒置 将培养皿倒置，在37℃恒温箱中培养24～48 h。 实验结果：全营养培养基中有较多的菌落，而尿素培养基中只有少量的菌落。 Step6：观察培养基中的菌落数 Step7：统计菌落数目 统计菌落数目：①选择菌落数在30～300的平板计数。 ②每个稀释度取3个平板取其菌落的平均值。 ③统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。 例题：用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中．得到以下几种统计结果，正确的是（ ） A. 涂布了一个平板，统计的菌落数是230 B. 涂布了两个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238 C. 涂布了三个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值163 D. 涂布了三个平板，统计的菌落数分别是2l0、240和250，取平均值233 例题：稀释涂布平板法分离纯化土壤中微生物的正确操作步骤是（ ） ①土壤取样 ②称取10 g土壤加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，制备土壤提取液 ③吸取0.1 mL溶液进行平板涂布 ④依次稀释至101、102、103、104、105、106、107的稀释度 A．①②③④ B．①③②④ C．①②④③ D．①④②③ 思考与练习 （1）为什么要用琼脂糖代替琼脂配制固体培养基？ （2