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第五章 基因的分离与鉴定
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第五章 基因的分离与鉴定
主要内容:
第一节 DNA克隆片段的产生与分离
第二节 重组体DNA分子的构建及导入受体细胞
第三节 基因克隆的实验方案
第四节 克隆基因的分离
第五节 重组体分子的筛选与鉴定。
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前言
克隆(clone)
在细胞水平:同一个祖细胞分裂而来的一群遗传
上同一的子细胞群体。
在分子水平:凡带有一段DNA插入序列的、独特
的寄主/载体单元叫做克隆。
基因克隆: 。
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基因克隆的过程
1、用于基因克隆的DNA材料的选择以及DNA分
子的片段化;
2、外源DNA片段与载体分子的体外连接反应;
3、将人工重组的DNA分子导入它们能够进行正
常复制的寄主细胞的程序;
4、获得了重组体分子的转化子克隆的选择或筛
选。
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4
基因克隆的过程
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基因克隆的过程
例一:
---应用大肠杆菌作寄主进行DNA克隆的综合实验
方案 。
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应用大肠杆菌作寄主进行DNA克隆的综合实验方案
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基因克隆的过程
例二:
---真核基因克隆的基本步骤
。
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真核基因克隆的基本步骤
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前言
基因组文库(genomic library):
即基因文库(gene bank):是含有某种生物体全部
基因的随机片断的重组DNA克隆群体。
构建基因文库时先提纯生物的总DNA,通过机械
剪切或酶切使其成为一定大小的片段,连接到适
当载体(常为λ噬菌体)上,经体外包装转染细
菌,得到一群含不同DNA片段的重组噬菌体颗
粒。
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第五章 基因的分离与鉴定
第一节 DNA克隆片段的产生与分离
第二节 重组体DNA分子的构建及导入受体细胞
第三节 基因克隆的实验方案
第四节 克隆基因的分离
第五节 重组体分子的筛选与鉴定。
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第五章 基因的分离与鉴定
第一节 DNA克隆片段的产生与分
离
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第一节 DNA克隆片段的产生与分离
一、基因组DNA的片段化
二、DNA片段的大小分部
三、编码目的基因的克隆片段的富集 。
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第一节 DNA克隆片段的产生与 分离
一、基因组DNA的片段化
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一、基因组DNA的片段化
1、利用限制酶片段化基因DNA:
单酶消化的产物一般分子较大,选择时要考虑到
载体容量(如λ噬菌体插入片段不超过25kb),
为此可选用识别4bp的限制酶(切割平均长度为
256bp) ,识别6bp的限制酶切割平均长度4096
bp
。
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一、基因组DNA的片段化
简单的一种办法则是利用限制酶消化绐体基因组
DNA,这种消化产物,不经过凝胶电泳分部分
离,就直接用来同载体分子作连接反应的克隆方 法,叫做鸟枪法(shotgun approach)
。
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一、基因组DNA的片段化
1、利用限制酶片段化基因DNA:(缺点)
(1)所形成的重组体分子,实际上是一群带有
大小不同的插入片段的重组体的混合群体,从中
筛出目的基因工作量大。
(2)在目的基因中可能存在数个识别位点,故
需要几次克隆才可能获得目的基因的全序列。
(3)片段太大或太小出现不能克隆的现象
。
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一、基因组DNA的片段化
2、基因组DNA的双酶消化:
双酶切产生的DNA片段平均大小一般不超过
1kb,它们存在着随机序列重叠,用蔗糖梯度离
心或凝胶电泳可将这些片段群体按大小分开,可
得到的分子量大小不等的随机DNA片段群体
。
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第一节 DNA克隆片段的产生与分离
一、基因组DNA的片段化
二、DNA片段的大小分部
三、编码目的基因的克隆片段的富集 。
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第一节 DNA克隆片段的产生与 分离
二、DNA片段的大小分部
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二、DNA片段的大小分部
1、构建完全的基因文库(gene library: gene 片
段之集合体)不需要大小分部。
2、特定要求需要:对片段化的DNA群体进行按
大小分部分离;
通常使用琼脂糖凝胶电泳或蔗糖梯度离心。
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琼脂糖凝胶电泳
已知含目的基因克隆片段的大小范围,可在克隆
前用琼脂糖凝胶电泳将DNA群体按大小分部分
离。
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蔗糖梯度离心
蔗糖的最大密度是1.3g/cm3,离心分离密度大于
1.3g/cm3的样品,如DNA、RNA,需要使用密度
比蔗糖大的介质。
重金属盐氯化铯(CsCl)是目前使用的最好的离心
介质,它在离心场中可自行调节形成浓度梯度,
并能保持稳定。
在氯化铯形成的密度梯度中,离心管顶部的密度
为:1.65g/cm3,底部为:1.75g/cm3。
DNA的密度是1.70g/cm3,会停留在离心管的中
部。
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第一节 DNA克
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