10第5章%20基因的分离与鉴定.doc

第五章 基因的分离与鉴定 王印 王印制作 1 第五章 基因的分离与鉴定 主要内容： 第一节 DNA克隆片段的产生与分离 第二节 重组体DNA分子的构建及导入受体细胞 第三节 基因克隆的实验方案 第四节 克隆基因的分离 第五节 重组体分子的筛选与鉴定。 王印制作 2 前言 克隆（clone） 在细胞水平：同一个祖细胞分裂而来的一群遗传 上同一的子细胞群体。 在分子水平：凡带有一段DNA插入序列的、独特 的寄主/载体单元叫做克隆。 基因克隆： 。 王印制作 3 基因克隆的过程 1、用于基因克隆的DNA材料的选择以及DNA分 子的片段化； 2、外源DNA片段与载体分子的体外连接反应； 3、将人工重组的DNA分子导入它们能够进行正 常复制的寄主细胞的程序； 4、获得了重组体分子的转化子克隆的选择或筛 选。 王印制作 4 基因克隆的过程 王印制作 5 基因克隆的过程 例一： ---应用大肠杆菌作寄主进行DNA克隆的综合实验 方案 。 王印制作 6 应用大肠杆菌作寄主进行DNA克隆的综合实验方案 王印制作 7 基因克隆的过程 例二： ---真核基因克隆的基本步骤 。 王印制作 8 真核基因克隆的基本步骤 王印制作 9 前言 基因组文库(genomic library)： 即基因文库(gene bank)：是含有某种生物体全部 基因的随机片断的重组DNA克隆群体。 构建基因文库时先提纯生物的总DNA，通过机械 剪切或酶切使其成为一定大小的片段，连接到适 当载体(常为λ噬菌体)上，经体外包装转染细 菌，得到一群含不同DNA片段的重组噬菌体颗 粒。 王印制作 10 第五章 基因的分离与鉴定 第一节 DNA克隆片段的产生与分离 第二节 重组体DNA分子的构建及导入受体细胞 第三节 基因克隆的实验方案 第四节 克隆基因的分离 第五节 重组体分子的筛选与鉴定。 王印制作 11 第五章 基因的分离与鉴定 第一节 DNA克隆片段的产生与分 离 王印制作 12 第一节 DNA克隆片段的产生与分离 一、基因组DNA的片段化 二、DNA片段的大小分部 三、编码目的基因的克隆片段的富集 。 王印制作 13 第一节 DNA克隆片段的产生与 分离 一、基因组DNA的片段化 王印制作 14 一、基因组DNA的片段化 1、利用限制酶片段化基因DNA： 单酶消化的产物一般分子较大，选择时要考虑到 载体容量（如λ噬菌体插入片段不超过25kb）， 为此可选用识别4bp的限制酶(切割平均长度为 256bp) ，识别6bp的限制酶切割平均长度4096 bp 。 王印制作 15 一、基因组DNA的片段化 简单的一种办法则是利用限制酶消化绐体基因组 DNA，这种消化产物，不经过凝胶电泳分部分 离，就直接用来同载体分子作连接反应的克隆方 法，叫做鸟枪法（shotgun approach） 。 王印制作 16 一、基因组DNA的片段化 1、利用限制酶片段化基因DNA：（缺点） （1）所形成的重组体分子，实际上是一群带有 大小不同的插入片段的重组体的混合群体，从中 筛出目的基因工作量大。 （2）在目的基因中可能存在数个识别位点，故 需要几次克隆才可能获得目的基因的全序列。 （3）片段太大或太小出现不能克隆的现象 。 王印制作 17 一、基因组DNA的片段化 2、基因组DNA的双酶消化： 双酶切产生的DNA片段平均大小一般不超过 1kb，它们存在着随机序列重叠，用蔗糖梯度离 心或凝胶电泳可将这些片段群体按大小分开，可 得到的分子量大小不等的随机DNA片段群体 。 18 第一节 DNA克隆片段的产生与分离 一、基因组DNA的片段化 二、DNA片段的大小分部 三、编码目的基因的克隆片段的富集 。 王印制作 19 第一节 DNA克隆片段的产生与 分离 二、DNA片段的大小分部 王印制作 20 二、DNA片段的大小分部 1、构建完全的基因文库（gene library： gene 片 段之集合体）不需要大小分部。 2、特定要求需要：对片段化的DNA群体进行按 大小分部分离； 通常使用琼脂糖凝胶电泳或蔗糖梯度离心。 王印制作 21 琼脂糖凝胶电泳 已知含目的基因克隆片段的大小范围，可在克隆 前用琼脂糖凝胶电泳将DNA群体按大小分部分 离。 王印制作 22 蔗糖梯度离心 蔗糖的最大密度是1.3g/cm3，离心分离密度大于 1.3g/cm3的样品，如DNA、RNA，需要使用密度 比蔗糖大的介质。 重金属盐氯化铯(CsCl)是目前使用的最好的离心 介质，它在离心场中可自行调节形成浓度梯度， 并能保持稳定。 在氯化铯形成的密度梯度中，离心管顶部的密度 为:1.65g/cm3，底部为:1.75g/cm3。 DNA的密度是1.70g/cm3，会停留在离心管的中 部。 王印制作 23 第一节 DNA克