定量pcr的实验流程及注意事项.doc

定量PCR实验流程与注意事项 北京元业伯乐科技发展有限公司 实验流程 RNA提取 RNA定量 DNA提取 Aurum Total RNA kit 反转录(RT) qPCR实验设计 qPCR预实验 iScript cDNA Synthesis Kit qPCR实验 数据处理 DNA模板 ● 模板的来源影响了引物与模板的结合 ● 在优化实验条件时应考虑到未来实验中要用到的模板浓度 影响DNA模板的因素 ● 样品的准备 ? 保证样品的质量与均一性 ● 模板的制备 ? RNA提取、含量、质量 ● 反转录 ● 引物与探针的优化 样品来源 ? 模板可以是gDNA、cDNA、质粒、PCR产物；RNA需要反转录成cDNA ? RNA可以直接定量，前提是RT的效率一致 ? DNA纯度：OD260/OD280=1.8，可以在1.6 - 2.0之间 ? DNA用量：0.1 ng -1 ug，最好10-100 ng/rxn ? DNA处理：基因组DNA及质粒DNA ? RNA纯度：OD260/OD280=2.0 ? RNA用量：60 ng–2 ug/ RT-rxn； ? RNA处理：DNA酶处理 ? cDNA用量：1-100 ng RNA反转录所得cDNA加1 uL/rxn 注意：100 uL的反转录体系最多可以反转录2ug 总RNA；如果>2 ug ，分成几管 DNA模板 ● 基因组DNA (完整的高分子量的DNA) 9 限制性酶切时不要切掉扩增区域 9 DNA贮存液煮沸10分钟后立即放入冰中 ● 质粒DNA 9 若质粒扩增有问题可在酶切使质粒线性化， 9 但酶切位点不能位于扩增序列中 ● cDNA 9 RNA中不能有基因组DNA污染 9（反转录前用RNAse-free DNase处理） 9 引物设计跨内含子，以避免基因组DNA扩增 9 确保RT reaction的效率和重复性 使用Experion?分析RNA GAPDH siRNA ● 评价RNA质量防止出现错误结论 A UCT 6.8 B UCT 4.3 实验流程 RNA提取 RNA定量 DNA提取 Aurum Total RNA kit 反转录(RT) qPCR实验设计 qPCR预实验 iScript cDNA Synthesis Kit qPCR实验 数据处理 qPCR实验设计需要考虑的问题 ● 绝对定量与相对定量 ● 使用SYBR或是Taqman探针（单重或多重PCR） ● 样品与对照组的设置 ● 标准品的选择 ● 看家基因的选择 ● 引物与探针的设计 ● 扩增子的设计 ● 实验循环条件的设计 多重PCR技术问题 1、引物及探针相互干扰问题 F R Q F R Q R R F R Q R Q R 多重PCR技术问题 2、共用资源的相互竞争 F R Q F R Q R R R R R R Q Q R Q Q Q R R R R Q Q R R Q R Q R Q Q Q R R Q R Q Q R Q R Q Q 多重PCR需要考虑的问题 ● 检验各引物对与探针的特异性 ● 所有的引物对Tm值应当一致 ● 所有的探针Tm值应当一致 ● 所有的扩增子长度应尽可能接近 ● 要单独验证各PCR的产物特异性与扩增效率 ● 多重PCR与单PCR相互印证 qPCR实验设计需要考虑的问题 ● 绝对定量与相对定量 ● 使用SYBR或是Taqman探针（单重或多重PCR） ● 样品与对照组的设置 ● 标准品的选择 ● 看家基因的选择 ● 引物与探针的设计 ● 扩增子的设计 ● 实验循环条件的设计 实验中不同样品的作用 ● 目标基因： 未知样品 ● 生成标准曲线： 标准品梯度 ● 监控系统故障： 阳性对照 ● 监控污染： 阴性对照 基因组对照 ● 校准生物学误差：看家基因 ● 降低其余误差： 样品重复实验 重复 ● 定量PCR中样本（包括对照及标准品）一般需要3个重复 ● 一般重复间允许的差异≤0.5Ct（理想的状态≤0.25Ct） ● 理想的重复: ? 准备反应体系master mix, 包括样本 ? 使用热启动taq酶，避免非特异产物的扩增 ? 分装mix时使用一个枪头 ? 充分旋涡震荡5秒以上 对照 ● 实验中要设立阴性对照和阳性对照 ● 对照和样品都要设重复 ● 阳性对照 9 结果可预知的样品 9 证明实验体系正常 9 防止PCR抑制造成的假阴性（特别是病原体 +/- 检测） ● 阴性对照 9 通常是无模板的对照 9 检查污染 9 进行反转录PCR，用未转录的对照来防止基因组DNA的污染 阴性对照－基因组对照 ? 目的：验证体系是否有基因组DNA 的污染 ? 方法：在反应体系中加入没有逆转录酶的反应的RNA样本 ? 替代方法：设计上下游引物分别位于不同的外显子区域上， 或者 外显子/外显