宏基因组测序及分析.docVIP

迪康?诺NGS应?交流会 宏基因组研究在肠道微?物中的最新研究应? 报告?：樊?才 2014.06 组织单位： 江苏省?产动物营养重点实验室 南京迪康?诺?物技术有限公司 1 ?纲 什么是宏基因组研究 宏基因组研究的分析流程 宏基因组研究的相关应用 2 什么是宏基因组研究？ ?需培养，直接从环境样品中提取全部微?物的DNA,结合?通 量测序来研究样品中的微?物组成及群落功能。 3 宏基因组研究热点 MetaHIT ? Metagenomics of Human Intestinal Tract ? ?类肠道宏基因组计划 ? HMP ? Human Microbiome Project ? ?类微?物组计划 ? GOS ? Global Ocean Sampling expedition ? 全球海洋调查 ? EMP ? Earth Microbiome Project ? 地球微?物计划 4 宏基因组研究的分析流程 提取环境样本DNA 获取测序数据 ?物信息学分析 5 提取环境样本DNA 宏基因组测序: ? 浓度≥50ng/ul; PowerWater? DNA Isolation Kit ? OD260/280:1.8-2.0; ? DNA两次需要量:≥3ug PowerSoil? DNA Isolation Kit PowerFecal? DNA Isolation Kit 6 ?物信息分析（?）数据质控 对测序数据的客观评价 数据质量 GC含量 1)去除接头污染和低质量数据 2)去除宿主污染 7 ?物信息分析（?）：物种组成(16S/18S/ITS) 1 2 1:物种丰度 2:样本聚类 8 ?物信息分析（?）：物种组成(16S/18S/ITS) 多样性曲线 PcoA分析 9 ?物信息分析（三）基因功能分析 代谢通路分析 10 ?物信息分析（三）基因功能分析 COG注释 CAzyme注释 11 ?物信息分析（四）个性化分析 1) 筛选与样品分组显著相关因?(基因、功能) 2) 基于筛选因?对样品进?主成分分析(PCA) 3) 基于筛选因?对样品进?聚类分析 （组数≥ 2,每组样品数 ≥ 10) 12 ?纲 什么是宏基因组研究 宏基因组研究的分析流程 宏基因组研究的相关应用 13 研究案例（?） Science：?胃中微?物酶可?于开发?物燃料 背景：纤维素是?然界中最丰富的碳? 化合物资源。?在反刍过程中涉及到纤 维素的分解，研究?的消化机制，有利 于寻找应?于?产?物燃料的酶。 14 研究思路 瘘管奶? 将柳枝稷样品置于?的瘤胃中培 养72?时，然后对附着在柳枝稷 样品上的所有微?物进?基因组 分析。 Illumina GAIIx ＋Illumina HiSeq2000 测序建库：200,300,3k,5k 双端测序：2*125、2*200、2*75 15 研究结果 总共识别了27,755 与碳?化合?物绑定模块或具有催化功能的候选基因 16 后续实验 选取233个候选基因，通过设计特定引物，然后使?PCR扩增，其中158 of 233 (68%) 得到了扩增产物。 随后将扩增产物通过载体（选择90个候选基因）导??肠杆菌，然后由 这些细菌产?了90种蛋?质酶，其中51 of 90 (57%)具有酶活性 17 研究案例（?）：宏基因组和宏转录组 背景：反刍动物排 放的CH4 是温室? 体的重要来源之? ?排放的甲烷?体 量存在差异性 转录组测序发现两 18 组之间是否存在差 研究思路 样本收集： 4 highest, 4 lowest, and 2 intermediate CH4 yields two separate times (20 samples total) ?通量测序： SSU rRNA gene sequencing：454 pyrosequencing 测序：Illumina HiSeq 2000 insert size of 250 bp、8kb 2 × 150 bp pair-end 19 研究结果 应用宏基因组分析，没有发现物种差异性 20 宏基因组 vs 宏转录组 2 甲烷?成代谢通路. (B）基因丰度. (C) 转录本表达差异. （D）转录本种类差异分析；RPM, reads (A) CO2/H per million. NS, no statistical significance in Wilcoxon rank-sum test; *, P 0.05; **, P 0.01; Error bars denote standard errors. 21 研究案例（三） Gut：运动可能增加肠道菌群多样性 背景：研究表明，肠道菌群多样 性的减少与肥胖及其他健康问题 相关，?肠道菌群多样性