分子生物学实验指南pdf.docVIP

分子生物学实验方案汇集 总 RNA 的提取（Trizol 法提取） 在收集到生物材料之后，最好能即刻进行 RNA 制备工作。若需暂时储存，则应以液氮 将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。在制备 RNA 时，将储存于冷冻柜的材料取出， 立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免 RNase 的作用。 1. 提取组织 RNA 时，每 50～100mg 组织用 1ml Trizol 试剂对组织进行裂解；提取细胞 RNA 时，先离心沉淀细胞，每 5-10 ╳106 个细胞加 1ml Trizol 后，反复用枪吹打或剧烈振荡以 裂解细胞； 2. 将上述组织或细胞的 Trizol 裂解液转入 EP 管中,在室温 15~30C 下放置 5 分钟； 3. 在上述 EP 管中，按照每 1ml TRIZOL 加 0.2ml 氯仿的量加入氯仿，盖上 EP 管盖子，在 手中用力震荡 15 秒，在室温下（15℃～30℃）放置 2～3 分钟后，12000g（2℃～8℃） 离心 15 分钟； 4. 取上层水相置于新 EP 管中,按照每 1ml TRIZOL 加 0.5ml 异丙醇的量加入异丙醇，在室温 下（15℃～30℃）放置 10 分钟,12000g（2℃～8℃）离心 10 分钟； 5. 弃上清，按照每 1ml TRIZOL 加 1ml 75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2℃～8℃） 离心 5 分钟，弃上清； 6. 让沉淀的 RNA 在室温下自然干燥； 7. 用 Rnase-free water 溶解 RNA 沉淀。 PCR 实验室常用 DNA 聚合酶有三种：TaKaRa TaqTM，TaKaRa EXTaqTM 和 PyrobestTM DNA Polymerase。TaKaRa TaqTM 是一般的 DNA 聚合酶，保真性较差，但价钱便宜，一般用于基 因表达的检测等。TaKaRa EXTaqTM 是具有 Proof reading 活性的耐热性 DNA 聚合酶，具有一 定的保真性，而且其扩增得到的 PCR 产物 3’端附有一个“A”碱基，如果希望直接将产物克隆 到 T-vector 可以用此酶。PyrobestTM DNA Polymerase 也是具有 Proof reading 活性的耐热性 DNA 聚合酶，其特点是保真性极高，扩增得到的 PCR 产物为平滑末端。如果进行基因的扩 增请使用此酶。 1. 按下列组成在 PCR 反应管中调制反应液： TaKaRa TaqTM 或 TaKaRa EXTaqTM 的配方 Reagent Quantity, for 50μl of reaction mixture 10X PCR buffer （Mg2+ free） 5 μl MgCl2（25mM） 如 TaKaRa TaqTM 加 3 μl 如 TaKaRa EXTaqTM 加 4 μl 2.5mM dNTP mix 4 μl 10μM Primer 上游 1 μl 10μM Primer 下游 1 μl Template DNA 1 μl Taq 或 EXTaqDNA Polymerase 0.25 μl Sterile deionized water Up to 50μl Total 50 μl /Sample PyrobestTM DNA Polymerase 的配方 Hurst Dong 1 12/18/2007 分子生物学实验方案汇集 Reagent Quantity, for 50μl of reaction mixture 10X Pyrobest buffer 5μl 2.5mM dNTP mix 4μl 10μM Primer 上游 1μl 10μM Primer 下游 1μl Template DNA 1μl PyrobestTM DNA Polymerase 0.25μl Sterile deionized water Up to 50μl Total 50μl /Sample ① 反应总体积根据实际情况进行调控，可以做 20~50μl 以节约试剂； ② 将上表各成分加入到 0.2ml 或 0.5ml 灭菌的 PCR 薄壁管中； ③ 如果不用 PCR 仪的加热盖，在反应混合液的上层加 30 ~50μl 的矿物油防止样品在 PCR 的过程中蒸发； 2. 按以下程序进行 PCR 扩增。 PCR 反应条件视模板、引物等的结构条件不同而各异，在实际操作中需根据具体的情况 以及 PCR 结果而进行优化。 Step Temperature, °C Time, min Number of cycles Note 起始变性 94~95 1-3 1 变性 94~95 0.5-2 退火温度比理论退