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山东地方标准Ⅰ群禽腺病毒感染诊断技术 第3部分:血清4型Ⅰ群禽腺病毒感染间接ELISA诊断技术2020版.pdf 4页

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DB37/T 3128.3—2020 Ⅰ群禽腺病毒感染诊断技术 第3 部分:血清4 型Ⅰ群禽腺病毒感 染间接ELISA 诊断技术 1 范围 本标准规定了间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测鸡血清4型Ⅰ群禽腺病毒抗体的技术规范。 本标准所规定间接酶联免疫吸附试验(ELISA)适用于鸡血清4型Ⅰ群禽腺病毒感染抗体的特异性检 验。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范动物检疫 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 血清4型Ⅰ群禽腺病毒 Fowl adenovirus group ⅠSerotype 4 是引起鸡心包积水-肝炎综合征的病原,主要造成3周龄~5周龄鸡突然死亡,并伴随有心包积水和 肝炎。 3.2 一抗 Primary antibodies 第一抗体就是能和特异性抗原特异性结合的蛋白。本标准的一抗为经离心后分离后鸡的血清待检样 品。 3.3 酶标二抗 HRP- labeled secondary antibodies 二抗是利用抗体是大分子的蛋白质具有抗原性的性质,去免疫异种动物,由异种动物的免疫系统产 生的针对于此抗体的免疫球蛋白,同时用辣根过氧化物酶进行标记的抗体。本标准中的酶标二抗为兔抗 鸡辣根过氧化物酶标记的IgG,其效价应在1:32以上。 3.4 血清标准品 1 DB37/T 3128.3—2020 SPF鸡接种血清4型Ⅰ群禽腺病毒经PCR检测为阳性后,制备的血清为阳性血清;SPF鸡的血清作为标 准阴性血清,PCR检测结果为阴性。 4 实验室要求 4.1 环境 4.1.1 实验室符合GB 19489 和GB/T 27401 要求,实验室必须为生物安全Ⅱ级(BSL-2 级)及以上实 验室。 4.1.2 生物样品应严格控制对环境的污染,试验结束后应将相关样品(血液)收集高压灭菌后,送有 资质的医用垃圾处理公司做最终处理。 4.2 人员 操作人员应接受实验室生物安全、实验室质量管理和血清学实验室检测技术培训。熟悉生物样品处 理以及熟悉间接ELISA检测结果的判断方法。 4.3 仪器设备 4.3.1 台式高速离心机(最大转速为15000 rpm)。 4.3.2 酶标仪。 4.3.3 微量移液器:最大量程分别为10 μL、20 μL、100 μL、1000 μL。 4.3.4 聚苯乙烯板。 4.3.5 水平振荡器。 4.3.6 恒温培养箱。 4.4 试剂或材料 除另有规定外,所有生化试剂均为分析纯,水符合GB/T 6682规定的一级水。 4.4.1 阳性血清,SPF 鸡接种血清4 型I 群禽腺病毒经PCR 检测为阳性后,制备的血清。 4.4.2 阴性血清,SPF 鸡血清,PCR 检测结果应为阴性。 4.4.3 血清4 型I 群禽腺病毒抗原:经浓缩纯化灭活后的全病毒,浓度为4.68 mg/mL。 4.4.4 酶标二抗:兔抗鸡辣根过氧化物酶标记的IgG,效价应在1:32 以上。 4.4.5 磷酸盐缓冲液(PBS),见附录A.1。 4.4.6 包被液,见附录A.2。 4.4.7 洗涤液,见附录A.3。 4.4.8 样品稀释液(封闭液),见附录A.4。 4.4.9 底物溶液,TMB 底物显色液。 4.4.10 终止液(浓度为2M),见附录A.5。 5 样品 5.1 样品的准备与处理 2 DB37/T 3128.3—2020 5.1.1 待检禽血清样品,每份不少于200 µL,无溶血。 5.1.2 用样品稀释液4.4.8 将被检血清样品稀释10倍(1:10,如10 µL 血清加入90 µL 稀释液中)。 注意:不要稀释对照

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