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【目的】:掌握BCA法测定蛋白质浓度的原理。
【原理】:
BCA(bicinchonininc acid)与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂,混合一起即成为,还原为CuCu苹果绿,即BCA工作试剂。在碱性条件下,BCA与蛋白质结合时,蛋白质将分子,工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复合物,最大光吸收强度与BCA一个Cu螯合二个 蛋白质浓度成正比。 【操作】 标准曲线的绘制:取试管七支、编号,按下表操作:
【计算】
(一) 绘制标准曲线。
(二) 以测定管吸光度值,查找标准曲线,求出待测血清中蛋白质浓度(g/L)。
(三) 再从标准管中选择一管与测定管光密度相接近者,求出待测血清中蛋白质浓度(g/L)。
【优缺点】
(一) 操作简单,快速,45分钟内完成测定,比经典的Lowary法快4倍且更加方便;
(二) 准确灵敏,试剂稳定性好,BCA试剂的蛋白质测定范围是20-200μg/ml,微量BCA测定范围在0.5-10μg/ml。
(三) 经济实用,除试管外,测定可在微板孔中就进行,大大节约样品和试剂用量;
(四) 抗试剂干扰能力比较强,如去垢剂,尿素等均无影响
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【器材】
(一) 7220型分光光度计
(二) 恒温水浴箱
(三) 中试管7支
(四) 枪式移液管
【试剂】
1、 试剂A:1%BCA二钠盐
2%无水碳酸钠
0.16%酒石酸钠
0.4%氢氧化钠
0.95%碳酸氢钠
混合调PH值至11.25。
2、 试剂B:4%硫酸铜。
3、 BCA工作液:试剂A 100ml + 试剂B 2ml混合。
4、 蛋白质标准液:用结晶牛血清白蛋白根据其纯度用生理盐水配制成1.5mg/ml的蛋白质标准液。(纯度可经凯氏定氮法测定蛋白质含量而确定)
5、 待测样品:用双缩脲测定法的样品稀释而成。
此法测定蛋白质浓度,近些年被科研工作者广泛选用。目前BCA法的试剂盒市面有售。
总之,虽然蛋白质含量的测定方法很多,但是,还没有一个完美的方法。在选择测定方法时,可根据实验要求和实验室条件决定。
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