植物基因转化及转基因植物地分析报告与鉴定.pdf

实用文档 植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定 〖实验目的〗 1． 了解创建烟草突变体库的方法； 2 ． 理解每种方法的基本原理； 3 ． 掌握农杆菌介导的转基因方法以及转基因产物筛选和鉴定的基本过程。 〖实验原理〗 随着越来越多植物的全基因组测序工作的完成， 在此基础上开展功能基因组的研究是目 前的核心研究内容之一。 植物插入突变体库的建立是功能基因组研究的一个重要内容， 在此 基础上也能进行正向遗传学及反向遗传学的研究。 在创制突变体的策略上， 传统方法是使用 物理或化学诱变方法获得， 其优点是可在尽可能短的时间内获得饱和突变体。 与传统的物理 和化学诱变方法相比，生物诱变 (T-DNA 和转座子插人诱变 ) 通常可标记突变基因，从而较为 容易地分离鉴定靶基因。 最近数年， 通过农杆菌介导的 T-DNA插入突变 已成为国际公认的植 物功能基因组学的主要研究方法之一。 烟草是植物基因组研究的一种模式植物， 其突变体库的创建是烟草功能基因组学研究中 的重要内容， 其目的是通过大规模的突变体库平台快速全方位的了解基因组中各个基因的功 能。 突变体的创制是遗传学研究的基础， 也是分离基因和基因功能鉴定的最要途径。 通过诱 导培养， 使烟草产生愈伤组织， 利用土壤农杆菌感染愈伤组织， 实现 T-DNA 标签在烟草愈伤 组织基因组中大量随机插人，利用植物细胞的全能性，经过抗性筛选，诱导分化，从抗性愈 伤组织获得烟草突变体再生植株， 获得各突变体的纯合材料， 从而建立烟草突变体的数据库， 然后分析突变性状与 T-DNA 的共分离关系，存在共分离的材料用适当的 Tail-PCR 克隆技术 获得 T-DNA 的侧翼基因组序列， 用其作探针筛选基因文库， 获取目标基因或克隆， 再进行下 一步的分析（图实验 4-1 ） 。 T-DNA 载体构建 转化植物（ T1，T-DNA杂合子 ) 收获 T2 种子 文案大全 实用文档 筛选 T2，获突变子，应为 3:1 分离 确定 T-DNA与突变型共分离的个体 产生纯合后代 克隆 T-DNA两侧的植物 DNA（Tail PCR) 利用侧翼 DNA序列作探针从该植物的 cDNA文库中钓取基因 基因功能的验证（遗传互补测验，分离的野生基因转化突变体，回复功能） 图实验 4-1 T-DNA 标签克隆基因的基本流程 TAIL-PCR 分离法是利用多个嵌套的 T-DNA 插入序列特异性引物（根据 T-DNA 中靠近 右边界处的核苷酸序列设计的引物， Tm 值 57-62 ℃和一个短的随机简并引物（ AD，Tm 值 44-46 ℃）组合，以突变体基因组 DNA为模板，进行多次 PCR 反应，采取高温特异性扩 增与低温随机扩增相间进行的方法，最后获得 T-DNA 插入侧翼区特异性扩增片段（实验 图 4-2 ），可作为探针，筛选分离基因。 TAI