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最新整理资料 文档精选合集 ［应用纪要］使用Ostro样品前处理板结合UPLC/MS/MS对全血中的阿片类药物及其代谢物进行法医毒理学直接分析 ［应用纪要］ Jonathan P. Danaceau，Erin E. Chambers and Kenneth J. Fountain 沃特世公司（美国马萨诸塞州米尔福德） 简介 天然和合成阿片类药物一直是法医毒理学研究的一个重要方面。有比 例相当高的犯罪和/或死亡事件都是由误用或滥用麻醉镇痛药（如羟考 酮和氢可酮），以及非法阿片类药物海洛因所引起。法医实验室通常 需要分析全血样本中的不同药物以确定确切的死亡原因，或是判断是 否在药物作用下驾驶，或者出于其它犯罪或研究目的。过去，通常用 酸或酶使样品水解并释放出葡糖苷酸代谢物之后再进行GC/MS分析1。通 过酶水解将葡糖苷酸代谢物转化为其游离形式的处理步骤增加了分析 时间和成本，而且无法确保水解程度始终如一2。随着现代UPLC? /MS/MS 技术的出现，如今可直接对葡糖苷酸代谢物进行分析3-6。 全血分析可采用多种样品制备方法，包括液液萃取（LLE）和固相萃取 （SPE）。最简单的一种方法就是在细胞溶解之后进行蛋白质沉淀。 本研究中介绍了一种快速直接的样品制备方法，采用Ostro样品制备板 对全血样品进行预处理以裂解细胞，然后用乙腈沉淀，再用96孔板洗脱。所有样品预处理均在Ostro板孔中进行，无需离心或从各个离心管 中转移样品。 样品制备完成之后，对22种阿片类药物及其代谢物进行UPLC/MS/MS分析。葡糖苷酸代谢物可直接进行分析，无需酶水解或化学水解。校准曲线呈线性，并可轻松达到相应的检测限。 文档精选合集 ［应用纪要］ 实验 LC条件 系统： ACQUITY UPLC 色谱柱： ACQUITY UPLC BEH C18 2.1×100 mm，1.7 μm （部件号186002352） 柱温： 30 ℃ 进样体积： 10 μL 流速： 0.4 mL/min 流动相A： 0.1%甲酸的MilliQ水溶液 流动相B： 0.1%甲酸 梯度： 初始条件为2 % 的流动相B。流动相B在6 min内增加至47. 2%，然后在 0.5 min内返回至2%。重新平衡系统1.5 min。整个循环时间为8.0 min。 MS条件 质谱仪： Xevo TQD 电离模式： ESI+ 采集模式： MRM（离子通道参阅表1） 毛细管电压： 1 kV 碰撞能量（eV）： 针对具体化合物进行优 化（参阅表1） 锥孔电压（V）： 针对具体化合物进行优 化（参阅表1） 数据管理 Waters? MassLynx? 软件4.1版 样品描述 所有化合物和内标物（IS）均购自Cerilliant（德克萨斯州圆石）。另外，除氢吗啡酮-3-葡糖苷酸、可待因-6-葡糖苷酸和去甲丁丙诺啡-葡糖 苷酸之外，所有化合物均有对应的氘代内标。对于这些化合物，具有极为相似的响应的氘代IS，被选择作为替代物。 所有化合物的混合储备液（10 μg/mL；芬太尼浓度为2.5 μg/mL）用甲醇配制。工作溶液需每天以基质（血液）配制的高浓度标准品和QC样品 制备，并进行连续稀释以得到所需浓度。所有分析物的校准浓度范围为5至500 ng/mL，但芬太尼的浓度配制为其它分析物浓度的25%（1.25至125.00 ng/mL）。所有内标混合储液（5 μg/mL；芬太尼为1.25 μg/mL） 用乙腈配制。 样品制备 在Ostro样品制备板的孔中加入150 μL 0.1 M ZnSO4/0.1 M NH4CH3COOH的水溶液，制备全血样品。向ZnSO4/NH4CH3COOH溶液中加入50 μL全血样品，并简单混合（5 s），使细胞裂解。然后，在制备的样品中加入含有内标的乙腈600 μL。涡旋混合3 min之后，将样品洗脱至96孔收集板，在N2下蒸干，之后复溶于50 μL含0.1%甲酸的2%乙腈溶液中。取10 μL注入LC/MS/ MS系统。 结果与讨论 表1中列出了22种筛选化合物和代谢物，它们构成一组全面的化合物组，包括天然阿片类药物、半合成阿片类及合成麻醉性镇痛化合物。这些化合物多数为弱碱性，其pKa值大约为8至9。它们的极性范围较 广，LogP值的范围为-3.48（吗啡-3β-d-葡糖苷酸）至5.0（美沙酮）。所用MRM通道同见表1。除曲马朵和O-去甲基曲马朵之外，均列出了主要 MRM通道和确证MRM通道及其碰撞能量。 最新整理资料 % % 色谱图 从50 ng/mL校准标准品获得的所有化合物的代表性色谱图如图1所示。谱峰分配列于表1中。采用ACQUITY UPLC BEH C18 2.1×100 mm，1.7 μm色谱柱在5.5 min内完成所有分析物的分