陈军正式答辩1.ppt

沙眼衣原体主要外膜蛋白B细胞表位融合蛋白免疫原性的初步研究 Contents Diagram 背景 Ct的疫苗研制现状：灭活疫苗、减毒疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗、抗独特型疫苗、树突状细胞疫苗。 沙眼衣原体主要外膜蛋白（MOMP）成为Ct疫苗研究的靶抗原。 用MOMP全序列免疫时存在病理免疫问题。 关于Ct的T细胞表位研究较多，B表位的研究报道较少。 背景 Ct的实验诊断技术研究现状◆细胞生物学方法◆免疫学方法 ◆分子生物学方法 目的 1.预测Ｅ血清型Ct MOMP B细胞表位 2.构建B细胞表位基因的原核重组质粒 3. 获得B细胞表位融合蛋白 4.检测B细胞表位融合蛋白的免疫原性 研究方案 预测B细胞表位 1．Ct主要外膜蛋白氨基酸序列：检索自瑞士生物信息研究所提供的SwissProt蛋白质数据库。 2．多种方法预测E血清型Ct主要外膜蛋白B表位 3. B表位筛选： 用抗原性指数(AI) 综合评判Ct MOMP的B细胞优势表位。 预测结果 构建重组质粒 pET32a (+)/Ct MOMP B细胞表位引物设计 pET32a (+)/Ct MOMP B细胞表位重组质粒图 pET32a (+)/Ct MOMP B细胞表位重组质粒酶切鉴定图 测序鉴定 表达及纯化融合蛋白 pET32a (+)/Ct MOMP B细胞表位融合蛋白鉴定 纯化结果 免疫原性检测 动物：ICR小鼠 免疫方式：背部皮下多点注射 血清标本采集：尾静脉采血，收集血清-20℃保存 ELISA结果一 ELISA结果二 ELISA结果三 分析与讨论 本研究以Pet32a（+）为载体表达预测的B表位融合蛋白，结果能诱导ICR小鼠产生特异性抗体。（冯宇——Pet28a（+）载体） 表位融合蛋白P5P6、P7P8能与Ct全菌体发生结合，具有重要研究价值。（Su和Caldwell——2个种系能与Ct菌体结合） 表位融合蛋白P5P6、P7P8的血清抗体与E、D型Ct均能结合。（彭辉——L2型） 分析与讨论 进一步的研究方向： 1.进行抗体中和试验，验证是否具有免疫保护作用。 2.为制备Ct多表位疫苗、联合疫苗提供基础。 3.为Ct的血清学诊断试剂的研究提供理论基础。 结论 1.预测E型Ct MOMP B细胞的优势表位位于MOMP蛋白N端第73～81区段、第161-175区段、第217～225区段、第261～270区段和第377～386区段或它们的附近。 2. 成功构建了3个含B细胞表位的重组质粒；在原核表达系统内分别高效表达了表位融合蛋白；通过亲和层析法得到了纯化的表位融合蛋白。 3. 表位融合蛋白免疫小鼠血清学检测，表明具有较强的免疫原性；表位融合蛋白P5P6，P7P8诱导所产生的抗体能与D和E型Ct特异结合。 * * 答辩人：陈 军 导 师：张丽芳 教授 姜丽萍 教授 专 业：病原生物学 2008.5.17 背景 1 目的 2 方案与结果 3 讨论与分析 4 汇报内容 5 结论 2007 2006 2005 2004 沙眼衣原体（Ct）,最常见的性传播疾病 (STDs)病原体之一,与不良妊娠有关。 有多种血清型。 E型——我国最常见。 D型——全球流行最广泛。 全世界,8900万/年泌尿生殖道感者。 治疗后易复发，治疗成本较高 长期反复感染易遗留不可逆的病理变化 背景 迫切需要沙眼衣原体疫苗的问世！ 迫切需要准确的实验室诊断筛选方法！ 预测B细胞表位 构建重组质粒 原核表达及纯化重组蛋白 检测免疫原性 GOR——MOMP的二级结构 人工神经网络资源——跨膜区域 Hopp-Woods——亲水性 Janin——可及性参数 Emini——表面可能性 Jameson-Wolf——抗原性 表2　Ct MOMP的B细胞表位优势区域的平均抗原性指数( AI) 0.038 TRLIDERAAH 377~386 0.037 TKDASIDYHE 261~270 0.043 QSKPKVEEL 217~225 0.033 DNENQSTVKTNSVPN 161~175 0.045 VLKTDVNKE 73~81 AI Dominant regions of Amino acid sequence B-cell epitopes P1P2 P5P6 P7P8 引物设计与合成 退火获得目的基因 pET32a (+)/Ct MOMP B细胞表位重组质粒的构建 纯化、连接、转