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RNA干扰技术的原理与应用

RNA干扰( RNAinterference , RNAi )是通过小干扰 RNA ( small interference RNA, siRNA ) 造成目的mRNA特异性降解, 从而使基因转录后沉默的一种现象。这一现象广泛存在于自然界, 是生物体进化过程中抵御外来基因侵害的一种机制, 为稳定基因组发挥了重要作用。由于 RNAi可以作为一种简单、 有效的代替基因剔除的遗传工具,正在功能基因组学领域掀起一场真正的革命, 并将加快这个领域的研究步伐。 1
RNAi现象的发现及发展 1995年, Guo等用反义 RNA阻断秀丽新小杆线虫的 part
1基因的实验中发现, 正义和反义 RNA都阻断了该基因的表达,这与传统上对反义 RNA技术的解释相反。1998年 2月卡耐基研究院的 F i re等将双链 RNA ( double
stranded RNA, ds RNA)转入细胞内,发现靶基因的 mRNA发生了降解,证实高度纯化的 ds RNA 可以高效特异的阻断相应的基因表达,而且效率比单链 RNA至少高 2个数量级,首次揭示了 Guo等遇到的现象,即为 RNAi。 随后研究发现, RNAi现象广泛存在于各种生物中,是一种古老的重要保护机制, RNAi技术作为一种重要的研究手段大大加速了基因组学的研究进程,现已成为基因功能研究和基因治疗研究的热点。 在短短几年中,对 RNAi的研究取得了突飞猛进的发展, 许多令人振奋的报道相继出现, 2001年首次报道了在哺乳动物细胞培养中成功应用 RNAi技术抑制基因表达, 开创了 RNAi技术应用于高等生物基因功能研究的先河; 2002年, K ay研究小组首次报道了应用 RNAi技术在哺乳动物整体水平进行基因表达沉默的实验研究;2004年哺乳动物全基因组范围 RNAi研究也取得了重要进展,先后报道了用酶法构建全基因组 siRNA文库新技术和应用基因组 siRNA文库,从全基因组水平对高等动物基因功能进行高通量 RNAi研究。这些研究成果愈来愈表明, 生物体基因转化的最终产物不仅仅是蛋白质,还包括相当一部分 RNA。 2
RNAi的作用机制 细胞中 ds RNA 的存在是 RNAi形成的先决条件。ds RNA可以通过多种途径在细胞核或细胞质中产生。通过对 RNAi所进行的遗传学和生物化学的研究,现已初步阐明了其作用机制。RNAi的作用机制可分为三个阶段:起始阶段、 效应阶段和级联放大阶段。 起始阶段:由 RNA 病毒入侵,转座子转录,基因组中反向重复序列转录等所产生的 ds RNA分子在细胞内被一双链 RNA酶!型内切酶也叫 Dicer酶或 Dicer核酸酶同源物剪成 21~ 23 nt siRNA, 3’ 端带有 2个碱基突出的黏性末端, 5’ 为磷酸基团,此结构对于 siRNA行使其功能非常关键。剪切位点一般在U处, 具特异性。效应阶段: RNAi特异性的核酸外切酶、 核酸内切酶、 解旋酶、 辅助识别同源序列蛋白和其他一些蛋白与 siRNA结合成 RNA诱导沉默复合体R I SC ( RNA
inducing silence complex , R I SC)识别靶 mRNA,其中的反义链与靶 mRNA互补结合,正义链则被置换出来。继而, R I SC复合物中的RNase(可能是 Dicer)在靶 mRNA与 siRNA结合区域的中间将其切断。级联放大: 在 RNA 依赖性RNA聚合酶的作用下,以 mRNA为模板, siRNA为引物,扩增产生足够数量的 dsRNA 作为底物提供给Dicer酶,产生更多的 siRNA, 从而使效应阶段反复发生,一个完整的 mRNA被降解成多个 21~ 23 nt的小片段, 从而导致相应的基因表达沉默。在这一过程中的多个步骤都需要 ATP , 如 R I SC复合体的形成、siRNA与靶 mRNA的配对、 靶 mRNA的切割。另外,在 dsRNA复制过程中,两条链的分离可能也需要一个依赖 ATP的 RNA解旋酶。 dsRNA可通过细胞微管在细胞间传递, 实现dsRNA在整个个体中的散布。RNAi在植物、 线虫、果蝇等低等模式生物中,都可由 dsRNA诱导,在哺乳动物细胞中, > 30 bp的 dsRNA会引起干扰素效应和非特异性基因抑制, 导致 mRNA非特异性降解,是医疗上应用 RNAi的一大障碍,随后发现合成双链的只有 19~ 21 nt的 siRNA却可以避免这种效应, 特异性发挥 RNAi作用, 并发现在哺乳动物细胞中转入双链 RNA ( dsRNA )后导致转录后基因沉默比用核酶或反义 RNA更彻底、 更有效。E lbash i r等通过瞬时转染体外合成的 21 nt双链 siRNA成功诱导出了哺乳动物细胞