大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法.pdf

大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法 感受态细胞(Competent cells) ：常态的细胞不能摄入外部溶液中的DNA ，所以要转化质粒 DNA 进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。受体细胞经过一些特殊方法（如： CaCl ，RuCl 等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源 DNA 的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。 转化：是将异源 DNA 分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是 基因工程等研究领域的基本实验技术。 进入细胞的 DNA 分子通过复制表达，才能实现遗 传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰 系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。 α-互补现象：因为许多载体都带有一个LacZ 基因的调控序列和头 146个氨基酸的编码信息， 编码α-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补（α-互补）。 当这种载体转入可编码?－半乳糖苷酶C 端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基- β-D 硫代 半乳糖苷（IPTG ）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性， 但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所以称这种现象为α-互补现象。由互补产 生的α-半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物 5-溴-4-氯-3-吲哚- β-D-半乳糖苷(X-gal)而产 生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点， 当插入一个外源DNA 片段时，会造成 LacZ( α)基因的失活，破坏α-互补作用，就不能产生 具有活性的酶。所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。 方法一：TSS 方法制备感受态细菌（又称一步法） 一、准备工作 1、缓冲液 1×TSS 的配制 事先配制 1M 的氯化镁：20.3g 氯化镁(6 分子水结晶) ，定容于 100ml 去离子水后封装， 不用灭菌。 取干净的 100ml 量筒和 100ml 烧杯，用量筒量取 100ml 去离子水，加入至烧杯中，取 1 g 蛋白胨，0.5g 酵母抽提物，0.5g 氯化钠，10 g PEG(MW= 3350)，5ml DMSO，5ml 的 1 M 氯化镁，溶解后用盐酸或者氢氧化钠调整 pH 为 6.5，混匀后用 0.22um 滤器过滤除菌。 储存在 4 度，保质期约 6 个月。 2 、已划平板（或者用枪头沾取并稀释后涂布）并在培养箱中过夜培养的菌种—Dh5 α，用 于接种并振荡培养。两个锥形瓶，分别装有 30 ml 和 50ml LB，灭菌后置于4 ℃冰箱备用。 3、若干已灭菌的琼脂平板，一个未加抗生素，用于第二步的接种，其余做转化用。 二、感受态制备程序 前一天晚上调单菌落至 30 ml LB 中过夜培养（12-16h），按 1：100 比例将过夜培养的 菌液（500ul ）加入到新鲜的50 ml LB 培养液中，于 37 ℃振荡培养至 OD600 约为 0.4(培养 时间 2h40～50min) 。冰浴30 分钟后 4 度 1000g 离心 10min，弃上清，收获细菌。加入原体 积十分之一（这里为 5 ml ）的 1× TSS 液(冰预冷)悬浮细胞，然后分装成 100 μl/份，全部 冰上操作，-80℃保存。 三、转化 取一管（100 μl ）感受态细菌，（冻存细胞应置于冰上缓慢融化后立即使用）加入3-5 μ l DNA （0.1～100ng），轻轻混匀后冰浴 30min 。加入 0.9ml 含 20mmol/L 葡萄糖的 LB 培养 液，37 度 150r/min 温和振荡培养 60min ，涂布，室温放置约20 分钟后放于 37 度恒温培养 箱过夜培养（17-20h）。 方法二：CaCl2 法 细菌转化的方法多 Mendel 和 Higa （1970）的发现为基础，其基本方法是用冰预冷的CaCl2 或多种 2 价阳离子等处理细菌，使之进入感受态得以转化。 　　用 CaCl2 制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞，常用于成批制备感受态细菌。本法适 用于大多数大肠杆菌菌株，且迅速、重复性好。 　　1．从37℃培养